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时间:2018-11-11
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1、不同剂量的天花粉蛋白对Caski细胞凋亡的影响作者:张艳琼,黄利鸣,李红军,吴江锋【摘要】目的探讨天花粉蛋白(TCS)对人宫颈癌Caski细胞生长的抑制作用及量-效关系。方法不同浓度TCS作用于体外培养人宫颈癌Caski细胞株,采用吖啶橙荧光染色,荧光显微镜观察TCS对Caski细胞的生长抑制作用;透射电镜和TUNEL检测法观察Caski细胞凋亡及TCS诱导Caski细胞凋亡的量效关系。结果TCS对Caski细胞的生长具有明显的抑制作用,透射电镜和TUNEL法证实该抑制作用是通过诱导细胞凋亡实现的。在一定浓度范围内,细胞凋亡数与TCS的浓度之间有剂量依赖性。结论TCS能诱导体
2、外培养Caski细胞凋亡,最佳浓度为60μg/ml。【关键词】天花粉蛋白;Caski细胞;细胞凋亡 Abstract:ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectofdifferentdosetrichosanthin(TCS)onCaskicells.MethodsTheantiproliferativeeffectofdifferentdoseTCSonCaskicellsicroscope.TheTUNELassayandelectromicroscopeeasurementofapoptosisofdifferentdoseTCSonThe
3、Caski.ResultsTheapoptosisofdifferentdoseTCSonCaskiCellsactedastheantiproliferation.ThequantityoftheapoptosisoftheCaskicellsdependedonTCS'dosel. Key的块根中提取的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingprotEin,RIP),迄今的研究发现TCS具有抗绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤、白血病和子宫颈腺癌等恶性肿瘤作用[1,2]。本实验旨在研究TCS对人子宫颈磷癌细胞的作用,并探讨其量-效关系,为TCS在抗宫颈癌
4、的临床应用提供实验依据。 1材料与仪器 TCS购自上海金山制药厂(1.2mg/ml);RPMI-1640培养基购自Gibcol公司;10%新生牛血清购自杭州四季青公司;吖啶橙购自Sigma公司;DNasEI购自上海博亚生物技术有限公司;TritonX-100购自华美生物工程公司;DAB试剂盒购自北京中山生物技术有限公司;TUNEL试剂盒购自Roche公司;倒置显微镜和多功能显微镜及图像分析系统购自德国Leica;H-7500型透射电镜购自日立。 2方法 2.1细胞培养人子宫颈鳞癌Caski细胞株(中国协和医科大学基础研究所生物物理教研室馈赠),培养于5%CO2,37℃
5、湿化孵箱中。培养基RPMI-1640中含10%新生牛血清,0.1U/L青霉素,0.1U/L链霉素,所有实验均取对数生长期细胞。 2.2倒置和荧光显微镜观察细胞的形态学变化体外培养的Caski细胞用PBS处理为阴性对照组、实验组分别用不同浓度(20,40,60,80,100μg/ml)TCS处理24h和48h后,加入0.01%吖啶橙磷酸缓冲液(pH6.0)50μl,轻轻混匀,静置2min后,于荧光显微镜下观察并记录图像。 2.3透射电子显微镜观察实验组以60μg/ml的TCS处理Caski细胞24h和48h,PBS处理为阴性对照组。2.5%戊二醛固定、包埋、超薄切片,醋酸双
6、氧铀和枸橼酸钠硝酸铅双重染色后,倒置电镜下观察并拍照。 2.4脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测实验组用不同浓度(20,40,60,80,100μg/ml)TCS处理Caski细胞24h。按TUNEL试剂盒说明操作。用DNaseⅠ处理Caski为阳性对照,试剂2替代TUNEL反应混合溶液为阴性对照。凋亡细胞的判断:胞核棕黄色染色为阳性,阴性细胞不显色。 2.5图像分析软件定量分析每一玻片任选10个视野,计算在200倍光镜下检测凋亡阳性细胞的个数、平均面积和平均灰度[3]。数据统计学分析用SPSS10.0统计软件(t检验)。 3结果 3.1倒
7、置显微镜下观察对照组细胞呈梭形,贴壁牢固、密集,折光性好,胞质饱满;实验组中经20μg/mlTCS作用48h后细胞间隔增大,细胞体积缩小,胞浆凝缩,折光率增强,贴壁性差;60μg/mlTCS浓度作用48h脱落细胞数增加,细胞表面出现发泡现象;TCS药物浓度达到100μg/ml作用24h后即出现上述特征。 3.2荧光显微镜下观察经吖啶橙荧光染色后,长链的DNA在荧光显微镜592nm波长紫外线激发下发出绿色荧光,而RNA发出黄色或黄绿色荧光。本实验的阴性对照组的细胞核DNA为绿色均匀荧光(图1);各实验组
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