单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞dna的氧化损伤及修复

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1、单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化损伤及修复【关键词】单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复　　摘要：目的观察小鼠成纤维细胞由过氧化氢(H2O2)引起的DNA损伤及其修复，并详细介绍单细胞凝胶电泳技术。方法培养NIH3T3细胞，H2O2造成细胞氧化损伤，单细胞凝胶电泳技术(SCGE，etAssay)检测细胞DNA的损伤情况。结果①建立了H2O2致NIH3T3细胞DNA损伤的分级图谱；②H2O2引起的小鼠成纤维细胞DNA单链断裂与H2O2的浓度呈依赖性关系；③细胞在除去H2O2后15min已出现明显修复，多数修

2、复可在1h内完成，但少数修复可能需要较长时间才能完成。结论单细胞凝胶电泳技术是一种简便、敏感的检测DNA氧化损伤的方法。　　关键词：单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复　　OxidantinducedDNAdamageandthereparation　inNIH3T3mousefibroblastsbysinglecellgelelectrophoresis　　ABSTRACT:ObjectiveTostudyH2O2inducedsinglestrandbreaks(SSB)formationinDNAandthere

3、parationinNIH3T3mousefibroblastsbysinglecellgelelectrophoresistechnique(SCGE,etAssay)andtointroduceSCGE.MethodsTheNIH3T3mousefibroblastsageinedbySCGE.Results①H2O2induceddamageclassgraphoftheDNAetintheNIH3T3mousefibroblastsagedDNAedependentandcouldbeachieved15minafterincubat

4、ion.Thedataindicatedthatmostreparationsighttakelongertime.ConclusionSinglecellgelelectrophoresistechniqueisasimpleandsensitivemethodtodetermineoxidationinducedsinglestrandbreaks(SSB)formationinDNA.　　KEYEM和小牛血清(FBS)购自Sigma公司；细胞培养平皿为Coring公司产品；etAssay试剂盒购自Trevigen公司。　　1.2细胞培养

5、及H2O2损伤方法DMEM培养液中加入10%(体积分数)小牛血清(FBS)、青霉素和链霉素各100u/mL。NIH小鼠成纤维细胞(NIH3T3)用该培养液调整至3.3×104个细胞/mL的细胞悬液，将细胞接种于直径35mm的培养皿(3mL/皿)，于37℃、5%(体积分数)CO2的细胞培养箱中培养24h。置换成不含小牛血清的DMEM，在培养皿中加入H2O2使终浓度分别为0.3-0.5mmol/L，培养15min。再次置换成新鲜的含10%(体积分数)小牛血清的DMEM，分别于H2O2处理后即刻、15、30、60、120min收集细胞进行单细胞凝胶

6、电泳分析。　　1.3单细胞凝胶电泳(etAssay)本方法的原理是先将细胞固定在葡聚糖凝胶中，用碱(0.3mol/LNaOH)将DNA变性，然后使DNA裂解所形成的片段在电场中迁移，没有受损伤的DNA，因分子较大迁移较慢保留在原来核的位置，而受损伤的DNA则被裂解成较小的片段而发生明显的迁移，DNA被荧光染色后在荧光显微镜下观察，可见裂解的DNA片段形成象彗星一样的长尾，根据“彗尾”的形状、亮度、尾长评价DNA的损伤。收集的细胞与10g/L低熔点葡聚糖凝胶(保温在40℃，pH10，PBS溶解)混合。将此细胞悬液铺敷于预先已铺设了一层1g/L葡

7、聚糖凝胶的玻片上，玻片在4℃放置10min后，被置于溶胞液中[2.5mol/LNaCl、100mmol/LEDTA、10mmol/LTris、1%(体积分数)TritonX100，pH=10]4℃，60min。然后水平地置于裂解液中(0.3mol/LNaOH、1mmol/LEDTA，pH>13)4℃，20-40min，TBE缓冲液洗两次，每次5min。于TBE缓冲液中电泳10min(1V/cm)，乙醇脱水，自然干燥，滴加SYBRGreen于凝胶层上，在荧光显微镜下观察细胞形成的DNA彗尾。　　1.4DNA彗尾级别的记录根据DNA损伤后形

8、成的荧光彗尾的形状、头的亮度及尾的长度将其分为5个级别，以表示DNA损伤的程度。根据预先制成的标准图谱(图1)，每个样品记录100个细胞的DNA彗尾的级别填入表1，