ezrin和merlin基因在胰腺癌细胞中的表达

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1、ezrin和merlin基因在胰腺癌细胞中的表达【摘要】目的：研究ezrin和merlin基因在胰腺癌细胞中的表达情况及其对胰腺癌细胞生物学行为的影响。方法：应用RTPCR与TT实验、流式细胞术、迁移实验和细胞黏附实验观察转染基因对细胞增殖、迁移和黏附能力，细胞周期及凋亡的影响。结果：ezrin和merlin基因在8株细胞中均有不同程度的表达，其表达水平与胰腺癌细胞的分化程度无关。与对照组相比，转染ezrin和merlin基因的S)家族成员之一,与merlin蛋白同属于4.1蛋白超家族成员。人ERM之间有75%～80

2、%的同源性,人merlin与ERM蛋白仅有45%的同源性[1]。ezrin与merlin蛋白主要定位于与细胞骨架重塑有关的区域，如细胞膜的皱褶、动力微丝以及卵裂沟等部位，主要参与上皮细胞中细胞骨架与胞膜之间的连接，具有维持细胞形态和运动、连接黏附分子及调节信号转导等功能[2]。大量研究表明,ezrin蛋白作为近年在肿瘤侵袭和转移研究中的相关蛋白，在很多肿瘤组织中都有异常表达,并与促肿瘤侵袭转移有关。merlin蛋白是第一个被发现具有肿瘤抑制作用的蛋白质，研究发现当其编码基因发生突变时，merlin蛋白失活,其生长抑制功

3、能丧失,最终导致肿瘤的形成。关于ezrin和merlin蛋白在胰腺癌中的研究，国内外报道较少。本实验的研究目的是通过观察ezrin和merlin蛋白在胰腺癌细胞中的表达情况，来探讨它们之间可能存在的关系，以及分别转染野生型ezrin和merlin基因后各自对对方的影响和对肿瘤细胞生物学行为的影响，为以后这两种蛋白的临床应用打下一定的基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1细胞系和质粒人胰腺导管上皮细胞系HPDE和人胰腺癌细胞系COLO357、SI1640培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。pcDNA3.

4、1+HA、pcDNA3.1+HAezrin和pcDNA3.1+HAmerlin质粒由德国美因茨大学苏占海博士惠赠。　　1.1.2试剂质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司;逆转录多聚酶链反应(RTPCR)试剂盒购自Toyobo公司;鼠抗人ezrin单克隆抗体购自SantaCruzBiotech公司;兔抗人merlin单克隆抗体及鼠抗人HA单克隆抗体购自CellSignalingTech公司;G418购自Sigma公司;脂质体Lipofectamine2000及Trizol购自Invitrogen公司。　　1.2实验

5、方法　　1.2.1逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测ezrin和merlin基因mRNA表达水平Trizol试剂提取细胞总RNA,经逆转录获得cDNA。取2μl质粒行PCR反应。ezrin基因引物：上游为5′ATGCCGAAACCAATC　　AATGT3′，下游为5′GGCCAAAGTACCACACTTCC3′,扩增片段大小为139bp。merlin基因引物：上游为5′ACCGTTGCCTCCTGACATAC3′，下游为5′GGCCTCG　　ATTTCTGTCTTGA3′,扩增片段大小为178bp。

6、G3PDH基因引物：上游为5′ACCACAGTCCATGCCAT　　CAC3′，下游为5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′,扩增片段大小为450bp。引物根据GenBank中所查到的ezrin和merlin全基因序列应用PrimerPremier5.0软件自行设计，由Invitrogen公司合成。PCR反应体系50μl。反应条件：94℃预变性2min;98℃变性10s，45℃(ezrin)/47℃(merlin)/60℃(G3PDH)退火30s，68℃延伸1min，共33个循环;68℃延伸10min

7、。取4μl产物2.0%琼脂糖凝胶电泳、照相。　　1.2.2TT)法检测细胞增殖分别选取对数生长期的4组细胞(Serlin)，以5×103孔-1的细胞数接种于96孔板中。分别在培养1、2、3、4d后，每孔加入MTT溶液(5mg·ml-1)20μl,继续培养4h后终止培养，吸干孔内培养液，每孔加入150μlDMSO，震荡至结晶充分溶解，选择492nm波长，在酶标仪上测吸光度(A)值。以时间为横轴，细胞增殖率(=A实验组/A空白对照组×100%)为纵轴绘制细胞生长曲线。　　1.2.5流式细胞仪分析细胞周期分别选取对数生长期的

8、4组细胞，用70%乙醇溶液于-20℃固定过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，依次加入50μg·ml-1碘化丙啶和1mg·ml-1RNaseA，室温避光孵育30min后上机检测。　　1.2.6Trans)上室加入细胞密度为1×105ml-1含0.1%BSA的无血清培养基200μl，24孔板下室加入含10%胎牛血清的培养基500μl，