ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序

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1、ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序【】目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力，探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应（rtpcr）及rna和蛋白表达水平；采用pcr法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pglbhe(-1444/+134)；采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在ec109、hela、a549和bgc823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达，其5′侧翼区-1444/+134序列具

2、有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。【关键词】逆转录聚合酶链反应(ezrinradixinmoesin)家族成员之一,主要参与细胞骨架与胞膜之间的连接[1]。研究证明，ezrin基因在食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌以及其他多种肿瘤细胞中过表达[26]。.133229.分析ezrin基因的外显子、内含子以及转录起始位点上游3000bp以内的dna序列，结果发现，ezrin基因转录起始位点上游约1600bp的范围为高gc含量区，存在cpg岛，且含有转录因子sp1的众多潜在结合位点。然而，ezr

3、in基因在肿瘤细胞中的表达是否受到cpg岛甲基化或转录因子sp1的调控，调控位点又在哪里？这些问题迄今仍不明确。本研究对我们实验室现有的几种癌细胞进行ezrin基因表达检测，同时克隆ezrin基因5′侧翼高gc含量区序列，检测此序列在癌细胞中的转录活力，为进一步揭示ezrin基因在癌细胞中的表达调控机制奠定基础。1材料与方法1.1质粒、细胞系及主要试剂质粒pgl3basic(pglb)、pgl3promoter(pglp)和prltk购自promega公司。食管癌sheec细胞株为本实验室建立[7]，其余细胞株购自中国科学院细胞库。trizol试剂、199培养基、dmem

4、培养基购自invitrogen公司；限制性内切酶、逆转录系统试剂盒、pcrmix、双荧光素酶报告基因分析系统购自promega公司；pvdf膜购自millipore公司；ezrinab1（3c12）购自neomarkers公司；βactin抗体（ac15）购自sigma公司；标准蛋白分子量（sc2035）、羊抗鼠igghrp（sc2031）、化学发光试剂购自santacruz公司。superfect转染试剂、质粒提取试剂盒购自qiagen公司。其他常用试剂为国产分析纯试剂。1.2细胞培养所有细胞均置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。ec109（食管癌）、

5、ec171（食管癌）、ec8712（食管癌）、sheec（食管癌）、bgc823（胃癌）、hela（宫颈癌）等细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的199培养液中；n87（胃癌）、a549（肺癌）、95d（肺癌）、hepg2（肝癌）等细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的dmem培养液中。贴壁细胞培养成单层后，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%edta）消化，传代培养，待达到一定数目[（1～2)×107]后收获细胞。k562（髓性白血病细胞株）细胞悬浮生长于含10%灭活小牛血清的rpmi199培养液中，细胞密度保持在(0.1～0.5)×106cells/ml，每3天传代一次，当密度

6、达到(1.0～1.5)×106cells/ml时收获细胞。需要进行瞬时转染实验的细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl，细胞接种密度为2×105cells/ml。细胞置37℃培养，细胞满度约为50%～60％时，转染质粒。1.3逆转录聚合酶链反应（rtpcr）trizol试剂提取细胞总rna，经逆转录获得cdna。扩增ezrin基因部分序列的上、下游引物分别为5′cgggcgctctaagggttct3′和5′tttcggtttctggtgagtatcctcgatccc3′，扩增片段位于ezrin基因的+30/+134（转录起始位点定义为+1）。扩增gapdh基因的上

7、下游引物分别为5′gaaggtgaaggtcggagtc3′和5′gaagatggtgatgggatttc3′，扩增片断位于gapdh基因的+108/+333（转录起始位点定义为+1）。将两对引物放入同一pcr反应体系，反应条件如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环30次；72℃5min。扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，于fluorchemtmis8900成像系统（alphainnotech,usa）分析成像，计算目的基因产物（ezrin）和内对照