angⅱ对腹膜间皮细胞ros和nadph氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄

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1、AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄：徐家云，刘章锁,马沙，娄丹，王宜娟，卢丹萍【摘要】目的探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及二代腹膜间皮细胞经黄芪注射液(AGI)预处理后的干预作用。方法体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至2代，静止24h后，随机分为：正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)。用荧光染料(DCF)及激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)。R

2、T-PCR检测NADPH氧化酶亚基p47phox的表达。ethodsPrimaryratperitoneummesothelialcellslyassignedtocontrolgroup(GroupA),AngⅡ(10-7mol/L)group(GroupB),AngⅡ+AGI(2g/mL)group(GroupC),andAngⅡ+AGI(1g/mL)group(GroupD).TheDCF-sensitivecellularROSeasuredbyfluorometricassayandconfocalmicroscopy.RT-PCRplo

3、yedtodetectthemRNAexpressionofNADPHoxidasesubunitp47phox,andp47phoxproteinexpressioninedbyinutes,ROSexpressionincreasedsignificantlyparedeachother(P<0.05).②AngⅡstimulatedNADPHoxidasesubunitp47phoxmRNAandproteinoverexpressions,andAGIinhibitedtheup-regulationofp47phoxmRNAover

4、expression.GroupsCandDmesothelialintracellularROSandup-overexpressionofNADPHoxidaseandcellularROSgeneration,mesothelialcell;angiotensinⅡ;reactionoxygenspecies;nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate(NADPH)oxidase;astragalus　　腹膜纤维化是长期腹膜透析(peritoneumdialysis,PD)患者的重要并发症之一，最终导致

5、腹膜结构异常、丧失超滤功能而退出腹膜透析。高糖腹膜透析液可引起腹膜发生氧化应激反应，导致腹膜结构和功能异常。近年研究证实，血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)参与了腹膜间皮细胞的转分化和细胞外基质的积聚，与腹膜纤维化的发生发展密切相关[1-2];烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶作为活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的调控酶，其胞浆亚基p47phox在多种组织的氧化应激反应中起着枢纽性作用[3-4]。调节NADPH氧

6、化酶亚基p47phox的表达及活性成为改善氧化应激状态、防治腹膜纤维化的重要切入点。色谱指纹图谱证实黄芪注射液有稳定的清除自由基、抗氧化的色谱峰[5]，超微结构证实黄芪注射液能拮抗高糖环境对腹膜间皮细胞的氧化应激损伤[6-7]。为此，本研究应用黄芪注射液来观察AngⅡ对腹膜间皮细胞的影响，以探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox等表达的影响、及黄芪的干预作用，为腹膜纤维化防治提供新的思路。　　1材料与方法　　1.1主要试剂胎牛血清(FBS)、DMEM/F12干粉培养基(GIBCO公司);胰蛋白酶(Amerasco公司)

7、;AngiotensinⅡ(Sigma,USA);黄芪注射液(正大青春宝药业有限公司生产，国药准字Z33020179，每支10mL相当于原材料20g);H2-DCFDA(MolecularProbes,USA);Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Fermentas公司);TaqDNA聚合酶(Fermentas公司);RNase抑制剂(GIBCOBRL公司);焦碳酸二乙酯(DEPC，博彩公司);DNAMarker(DL2000，TaKaRa公司);琼脂糖(Biolabs公司);兔抗大鼠p47phox抗体(Upstate公司，

8、USA);兔抗大鼠GAPDH抗体(Dako公司，Denmark);BCA法蛋白浓度测定试剂盒(Pierce公司);TEME