浅析AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用

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1、浅析AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用【摘要】目的探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及二代腹膜间皮细胞经黄芪注射液(AGI)预处理后的干预作用。方法体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至2代，静止24h后，随机分为：正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)。用荧光染料(DCF)及激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)。RT-PCR

2、检测NADPH氧化酶亚基p47phox的表达。Western印迹检测p47phox的蛋白表达。结果①AngⅡ可显著增加大鼠腹膜间皮细胞ROS产生，刺激20min后，ROS的表达较对照组显著上升(P【关键词】腹膜间皮细胞;血管紧张素Ⅱ;活性氧;NADPH氧化酶;黄芪ABSTRACT:ObjectiveToexploretheeffectsofangiotensinⅡonthereactiveoxygenspeciesofperitoneummesothelialcellsandexpressionofnicotinamide-ade

3、ninedinucleotidephosphate(NADPH)oxidasesubunitp47phoxaswellastheroleofastragalusinjection(AGI)interventionforsecond-generationperitoneummesothelialratperitoneummesothelialcellswereculturedintothesecondgenerationinvitro.Aftersynchronizationforhours,thecellswererandomly

4、assignedtocontrolgroup(GroupA),AngⅡ(10-7mol/L)group(GroupB),AngⅡ+AGI(2g/mL)group(GroupC),andAngⅡ+AGI(1g/mL)group(GroupD).TheDCF-sensitivecellularROSwasmeasuredbyfluorometricassayandconfocalmicroscopy.RT-PCRwasemployedtodetectthemRNAexpressionofNADPHoxidasesubunitp47ph

5、ox,andp47phoxprotEinexpressionwasexaminedbyWestern①AngⅡsignificantlyinducedtheproductionofintracellularROScomparedwithcontrol(P腹膜纤维化是长期腹膜透析(peritoneumdialysis,PD)患者的重要并发症之一，最终导致腹膜结构异常、丧失超滤功能而退出腹膜透析。高糖腹膜透析液可引起腹膜发生氧化应激反应，导致腹膜结构和功能异常。近年研究证实，血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)参与了腹膜

6、间皮细胞的转分化和细胞外基质的积聚，与腹膜纤维化的发生发展密切相关[1-2];烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶作为活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的调控酶，其胞浆亚基p47phox在多种组织的氧化应激反应中起着枢纽性作用[3-4]。调节NADPH氧化酶亚基p47phox的表达及活性成为改善氧化应激状态、防治腹膜纤维化的重要切入点。色谱指纹图谱证实黄芪注射液有稳定的清除自由基、抗氧化的色谱峰[5]，超微结构证实

7、黄芪注射液能拮抗高糖环境对腹膜间皮细胞的氧化应激损伤[6-7]。为此，本研究应用黄芪注射液来观察AngⅡ对腹膜间皮细胞的影响，以探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox等表达的影响、及黄芪的干预作用，为腹膜纤维化防治提供新的思路。　1材料与方法主要试剂胎牛血清(FBS)、DMEM/F12干粉培养基(GIBCO公司);胰蛋白酶(Amerasco公司);AngiotensinⅡ(Sigma,USA);黄芪注射液(正大青春宝药业有限公司生产，国药准字Z330XX9，每支10mL相当于原材料20g);H2-DC

8、FDA(MolecularProbes,USA);Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Fermentas公司);TaqDNA聚合酶(Fermentas公司);RNase抑制剂(GIBCOBRL公司);焦碳酸二乙酯(DEPC，