angⅱ对腹膜间皮细胞ros和nadph氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用

《angⅱ对腹膜间皮细胞ros和nadph氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用：徐家云，刘章锁,马沙，娄丹，王宜娟，卢丹萍【摘要】目的探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及二代腹膜间皮细胞经黄芪注射液(AGI)预处理后的干预作用。方法体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至2代，静止24h后，随机分为：正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)。用荧光染料(DCF)及激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)。RT-PCR检测NADPH氧化酶亚

2、基p47phox的表达。ethodsPrimaryratperitoneummesothelialcellslyassignedtocontrolgroup(GroupA),AngⅡ(10-7mol/L)group(GroupB),AngⅡ+AGI(2g/mL)group(GroupC),andAngⅡ+AGI(1g/mL)group(GroupD).TheDCF-sensitivecellularROSeasuredbyfluorometricassayandconfocalmicroscopy.RT-PCRployedtodetectthemRNAexpressionofNADPHoxi

3、dasesubunitp47phox,andp47phoxproteinexpressioninedbyEM/F12干粉培养基(GIBCO公司);胰蛋白酶(Amerasco公司);AngiotensinⅡ(Sigma,USA);黄芪注射液(正大青春宝药业有限公司生产，国药准字Z33020179，每支10mL相当于原材料20g);H2-DCFDA(MolecularProbes,USA);Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Fermentas公司);TaqDNA聚合酶(Fermentas公司);RNase抑制剂(GIBCOBRL公司);焦碳酸二乙酯(DEPC，博彩公司)

4、;DNAMarker(DL2000，TaKaRa公司);琼脂糖(Biolabs公司);兔抗大鼠p47phox抗体(Upstate公司，USA);兔抗大鼠GAPDH抗体(Dako公司，Denmark);BCA法蛋白浓度测定试剂盒(Pierce公司);TEMED(Sigma公司)，其余化学试剂为国产分析纯。　　1.2大鼠腹膜间皮细胞的分离与培养[8]健康清洁级雄性SD大鼠，体重180～220g，由河南科技大学机能实验中心提供，每只肌肉注射100mL/L水合氯醛约0.6～1.0mL。待麻醉后向大鼠腹腔内注射20～30mL2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/LEDTA消化液。2h后断颈处死大鼠，750m

5、L/L酒精全身浸泡消毒5min。将大鼠仰面放置于超净工作台上，沿腹白线依次剪开腹壁皮肤及肌肉，吸出腹腔内液体，移入15mL离心管中。1500r/min离心15min，弃上清，加入含100mL/LFBS的DMEM/F12培养液，轻轻用吸管吹打使之成为细胞混悬液，分装于25cm2的细胞培养瓶中。再加入培养基使之总体积达到4～5mL，放入条件为37℃、950mL/L空气、50mL/LCO2的细胞培养箱中培养。每3d更换一次培养基。免疫组织化学方法鉴定结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性，将2代腹膜细胞随机分为以下4组：正常对照组，AngⅡ(10-7mol/L)刺激组，两组用无血清的DME

6、M/F12培养基培养;黄芪注射液高浓度(2g/mL)干预组，黄芪注射液低浓度(1g/mL)干预组，两组提前孵育1h进行干预处理。在合适的时间点，观察以上各组各指标的变化情况。　　1.3细胞内ROS的测定ROS的测定按文献报道方法[9]。具体如下：将细胞传至激光共聚焦专用培养皿(Corning公司)，静止24h同步化后，KRH缓冲液清洗3次，将各组细胞用10mg/LH2-DCFDA避光孵育37℃15min，KRH缓冲液再清洗3次，激光共聚焦显微镜观察，激发波长488nm，发散波长505nm，摄像。测定各组荧光强度值，并以对照组荧光强度为基线，计算其他各实验组相对荧光强度值。　　1.4实时定量R

7、T-PCR检测总RNA提取按照Trizol试剂说明书操作。取2μg总RNA按反转录试剂盒说明书合成cDNA。用实时定量PCR仪(美国MJResearch)检测mRNA的表达。定量PCR反应体系：SYBRGreenMix7.5μL，引物各0.3μL，cDNA1.0μL，加三蒸水补足至15μL。反应条件：94℃预变性5min，92℃变性15s，60℃退火并延伸1min，共40循环，72℃终末延伸10min。PCR