浅析angⅱ对腹膜间皮细胞ros和nadph氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用

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1、浅析AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用【摘要】目的探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及二代腹膜间皮细胞经黄芪注射液(AGI)预处理后的干预作用。方法体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至2代，静止24h后，随机分为：正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)。用荧光染料(DCF)及激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)。RT-PCR检测NADPH氧化酶亚基p47phox的表达。ethods

2、Primaryratperitoneummesothelialcellslyassignedtocontrolgroup(GroupA),AngⅡ(10-7mol/L)group(GroupB),AngⅡ+AGI(2g/mL)group(GroupC),andAngⅡ+AGI(1g/mL)group(GroupD).TheDCF-sensitivecellularROSeasuredbyfluorometricassayandconfocalmicroscopy.RT-PCRployedtodetectthemRNAexpressionofNADPHoxidasesubunitp47ph

3、ox,andp47phoxprotEinexpressioninedbyEM/F12干粉培养基(GIBCO公司);胰蛋白酶(Amerasco公司);AngiotensinⅡ(Sigma,USA);黄芪注射液(正大青春宝药业有限公司生产，国药准字Z33020179，每支10mL相当于原材料20g);H2-DCFDA(MolecularProbes,USA);Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Fermentas公司);TaqDNA聚合酶(Fermentas公司);RNase抑制剂(GIBCOBRL公司);焦碳酸二乙酯(DEPC，博彩公司);DNAMarker(DL2

4、000，TaKaRa公司);琼脂糖(Biolabs公司);兔抗大鼠p47phox抗体(Upstate公司，USA);兔抗大鼠GAPDH抗体(Dako公司，Denmark);BCA法蛋白浓度测定试剂盒(Pierce公司);TEMED(Sigma公司)，其余化学试剂为国产分析纯。　　1.2大鼠腹膜间皮细胞的分离与培养[8]健康清洁级雄性SD大鼠，体重180～220g，由河南科技大学机能实验中心提供，每只肌肉注射100mL/L水合氯醛约0.6～1.0mL。待麻醉后向大鼠腹腔内注射20～30mL2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/LEDTA消化液。2h后断颈处死大鼠，750mL/L酒精全身浸泡消毒5

5、min。将大鼠仰面放置于超净工作台上，沿腹白线依次剪开腹壁皮肤及肌肉，吸出腹腔内液体，移入15mL离心管中。1500r/min离心15min，弃上清，加入含100mL/LFBS的DMEM/F12培养液，轻轻用吸管吹打使之成为细胞混悬液，分装于25cm2的细胞培养瓶中。再加入培养基使之总体积达到4～5mL，放入条件为37℃、950mL/L空气、50mL/LCO2的细胞培养箱中培养。每3d更换一次培养基。免疫组织化学方法鉴定结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性，将2代腹膜细胞随机分为以下4组：正常对照组，AngⅡ(10-7mol/L)刺激组，两组用无血清的DMEM/F12培养基培养

6、;黄芪注射液高浓度(2g/mL)干预组，黄芪注射液低浓度(1g/mL)干预组，两组提前孵育1h进行干预处理。在合适的时间点，观察以上各组各指标的变化情况。　　1.3细胞内ROS的测定ROS的测定按2结果　　2.1大鼠腹膜间皮细胞的鉴定培养的大鼠腹膜间皮细胞呈菱形、椭圆形、多边形等，细胞融合后，呈典型的铺路石样。免疫组化结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性。在AngⅡ10-7mol/L浓度作用12h后，RPMCs失去原来的整齐排列，细胞间隙增宽，但细胞形态未出现明显的改变(图1)。图1腹膜间皮细胞的形态Fig.1Morphologyofperitonealmesothelialc

7、ells(×200)A：正常大鼠腹膜间皮细胞的形态;B：血管紧张素Ⅱ刺激后大鼠腹膜间皮细胞的形态。　　2.2AngⅡ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用激光共聚焦显微镜观察DCF荧光强度代表ROS产生的量。正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)，在DCF孵育20min后，ROS的产生情况如图所示(图2)。统计学分析，腹膜间皮细胞经