灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法验证

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1、灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法验证赵加强1周荣光1,2杨兆祥1王金3袁正东21昆明制药集团股份有限公司，云南昆明650100；2昆明医科大学，云南昆明650500；3昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650224【摘要】目的：建立灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版要求，采用常规法对代表性的细菌、霉菌、酵母菌进行回收率测定，并对控制菌检查法进行方法学验证。结果：采用常规法，5种试验菌的回收率均大于70%。结论：可采用常规法对灯盏花乙素苷元进行微生物限度检查。.jyqk

2、l含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于24～26℃培养48h，用0.9%的无菌氯化钠溶液以10倍稀释法稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。取黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，于24～26℃培养7d，用5ml09%的无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，取洗脱液以10倍稀释法稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。22供试液制备取供试样品10g于灭菌容器中，加入pH70无菌氯化钠

3、-蛋白胨缓冲液100ml，混匀，得1∶10的供试液备用。23菌落计数方法及验证231菌落计数方法采用常规法对细菌、霉菌及酵母菌进行菌落计数，通过回收率测定进行方法学验证［3］。232回收率测定试验组：取1∶10供试液1ml、含50~100cfu试验菌的菌液1ml加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于32～35℃培养48h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待

4、凝固后，于24～26℃培养72h，观察记录菌落数。菌液组：取含50~100cfu试验菌的菌液1ml加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于32～35℃培养48h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于24～26℃培养72h，观察记录菌落数。供试品对照组：取1∶10供试液1ml加入平皿中，共制备10个平皿。在5个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，

5、于32～35℃培养48h，观察记录菌落数；在另外5个平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于24～26℃培养72h，观察记录菌落数。回收率计算方法：试验组的菌回收率（%）=（试验组菌落数平均值-供试品对照组菌落数平均值）/菌液组菌落数平均值×100%。24控制菌（大肠埃希菌）检查方法及验证241控制菌检查方法采用常规法对控制菌大肠埃希菌进行检查。242控制菌检查方法的验证试验组：取1∶10供试液10ml，含50~100cfu大肠埃希菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24

6、h。阳性对照组：取含50~100cfu大肠埃希菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。阴性菌对照组：取1∶10供试液10ml，含50~100cfu金黄色葡萄球菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。供试品对照组：取1∶10供试液10ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。检查方法：分别取上述试验组、阳性对照组、阴性菌对照组和供试品对照组的培养物02ml接种至装有5mlMUG培养基的试管内，32～35℃培养24h，在36

7、6nm紫外线下观察，若管内培养物出现荧光，为MUG荧光阳性；否则，为MUG荧光阴性。观察后滴加靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；若液面颜色无变化，为靛基质阴性。3结果由表1可见，采用常规法验证，枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%，说明灯盏花乙素苷元对上述5种菌株无明显抑制作用。由表2可知，灯盏花乙素苷元的控制菌检查可按常规法进行。4讨论灯盏花乙素苷元为人工半合成，不同生产工艺下得到的灯盏花乙素苷元产品，其所含杂质或溶剂残留成分往往不尽相同，其抑菌行为或抑

8、菌作用的强弱程度也往往不同。因此，当灯盏花乙素苷元生产工艺或方法发生变动时，应对产品的微生物限度检查方法进行重新验证。微生物限度检查是药品质量检查的重要内容。在人工合成药物的研制过程中，一些研究机构或研究人员往往只注重产品本身的化学成分质量研究，而忽视或根本不进行产品的微生物限度检查或方法学研究，这是不科学、不合理的。按照《中国药典》的要求，应对用于非规定灭菌制剂的合成原料药进行微生物限度检查及方法