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1、CFL2基因半定量多重RT【摘要】目的在CFL2基因功能的研究中,建立一种能检测CFL2基因mRNA表达水平的半定量多重RT-PCR体系。方法细胞总RNA经反转录合成cDNA,以GAPDH为内参与CFL2进行同管扩增,以常规PCR体系为参照对退火温度、Mg2+、dNTP和循环数等参数进行优化并与常规组比较,建立了检测C2C12细胞CFL2基因半定量多重RT—PCR体系。结果CFL2和GAPDH的cDNA同时PCR扩增后电泳条带清晰,与预期产物大小一致,两对引物间无明显竞争,其扩增效率和特异性与单一基因的RT—PCR体系相同。结论成功建立CFL2基因半定量多重RT—PCR方法,有利于
2、半定量检测CFL2mRNA表达变化。【关键词】CFL2基因;半定量RT-PCR;检测方法Abstract:ObjectiveToestablishasemi-quantitativemultipleRT-PCRmethodforthemeasurementofmRNAlevelinCFL2gene.MethodscDNAplifiedtogetherersofCFL2andGAPDH(asinternalcontrol)genes.Inthissystem,theannealingtemperature,Mg2+anddNTPconcentrations,andcyclenumbe
3、rized.ResultsTheresultshoplifiedtogetherbyPCR,thereplificationbetersetsandtheefficiencyandspecificityofamplificationplegeneRT-PCRsystem.ConclusionsAsemi-quantitativemultipleRT-PCRmethodeasuretheexpressionlevelofCFL2mRNA. Keyi-quantitativeRT-PCR;detectionmethod 人类基因组计划的完成,标志着人类进入了后基因时代。在研究不同实验
4、条件下特异基因表达水平的差异时,半定量RT-PCR检测方法因其成本低、操作简便、普通实验室容易做到,对设备和研究者要求低等特点而被经常使用,尽管目前已有许多改进的检测方法和技术用于定量分析mRNA表达量,但实际上多数研究的焦点并不是检测转录水平微小的变化或确切的分子数目,而是检测其表达水平变化是否显著(至少增加或减少1.2倍以上)[1]。只要对相关参数通过正确的实验并进行合适的控制,半定量RT-PCR完全可以反映基因的表达水平[1-5]19-25。Cofilin2(CFL2ormuscle-typecofilin)基因是一个与肌肉肉质密切相关的基因,CFL2基因高表达对细胞内某些肌
5、球蛋白重链基因的表达有明显影响,推测CFL2基因可能与猪的不良肉质性状相关从而导致猪肉的品质下降,肉多汁性减少,口感变差[6]。本文将以GAPDH基因作为内参基因,同管扩增CFL2和GAPDH,通过实验建立一种检测CFL2基因表达水平的半定量方法,为研究CFL2基因表达提供参考。 1实验材料与方法 1.1细胞及主要试剂C2C12细胞株购于北京中国协和医科大学细胞中心;胎牛血清(FBS)和Trizol分别购自Hyclone和Invitrigen公司;TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0反转录试剂盒;引物由大连宝生物公司合成。 1.2C2C12细胞总RNA的提取
6、利用Trizol法对总RNA进行抽提,DEPC水溶解,用核酸分析仪测定260、280和310nm波长处OD值,观察RNA完整性和有无降解及基因组DNA污染。 1.3反转录按照TaKaRa公司AMV反转录试剂盒说明书进行,选择RNA纯度高完整性好的RNA样品转录15管,以保证对RT-PCR体系优化过程中拥有含量一致模板。 1.4引物的选择与Tm值的确定PCR引物使用软件primer5.0进行设计,由大连宝生物公司合成。为控制引物对之间的竞争,CFL2引物两对(F1,F2),GAPDH一对(Fc)。引物序列如下:F1sense:5'-TACGATGCCACATACGAAAC-3'(
7、Tm54.3 ℃);Antisense:5'-AAGGGAAACTACAACACTGCC-3'(Tm56.2℃),产物长度231bp;F2sense:5'-ATCTTGGTGGGTGACATTGG-3'(Tm57.5℃);Antisense:5'-CAAGGGAAACTACAACACTGC-3'(Tm55.0℃),产物长度322bp;GAPDHsense:5'-GCAGTGGCAAAGTGGAGATT-3'(Tm57.5 ℃);antisense:5'-TGAAGTC