基于荧光通用引物的多重定量rt-pcr基因表达谱研究平台的构建、优化及应用

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1、基于荧光通用引物的多重定量Rl’P-CR基因表达谱分析平台的构建、优化及应用的14对基因嵌合特异引物的序列设计;逆转录反应体系的研发过程中，主要考察了下游嵌合特异引物的量，逆转录延伸时间;多重PCR体系的研发过程中，主要考察了通用引物与上游嵌合特异引物的用量比，PCR反应程序优化(M扩浓度、退火时间、延伸时间等)，降落式(Touehdown，TD)PCR结合通用引物补加方案和最低模板检测灵敏度等。实验结果表明，该技术的检测灵敏度为102拷贝，通用引物与上游嵌合特异引物的比例以1:1为佳，并且验证了该技

2、术的重复性和准确性。降落式(Touchdown)PCR结合通用引物补加实验表明，该优化步骤可大大改善低丰度表达基因的扩增。通过对2个品系(C3H/HeJ和C57BL/6J)巧日龄小鼠的下丘脑和皋丸组织中的n个基因的表达分析，在下丘脑中找到了一个差异表达的基因月毋芍可用于进一步的基因功能研究。关键词:通用引物;多重定量RT一pcR;基因表达谱分析;性发育启基于荧光通用引物的多重定量Rl’P-CR基因表达谱分析平台的构建、优化及应用DEVELOPMENT，OPTIMIZATIONANDAPPLICAI，I

3、ONOFTHEEXPRESSIONANALYSISPLArFORMBASEDONMUIJIPLEXQUANTfrATIVERT-PCRUSINGFLUORESCENTUNIVERSALPRIMERSABSTRACTMultiPlegeneexPressionanalysis15ananeffeetivewaytosereeneandidategenesandideniifygenefunetionontranseriPtionallevel.Currenily，there15stillaniehefo

4、rqutitativemoderate一throughPut(10一30genes)exPressionanalysismethodsinallcommonlyusedmethods，ineludingcDNAarraywhieh15high一throughPutbutlaeksinquatitavecapability，andreal一timeqPCRontheeonirary.AmultiPlexquantitativeRT一PCRteehnologywithauniversalfluoresee

5、niPrimerwasestablished.ItemPloysaehimerie一Primer-indueed一universal一PrimeramPlifieationmethodthatensurestargetgenesamPlifiedinaeonstaniratioduringthereaction.Inthefirstfeweyeles，twogene一sPeeifiePrimers，whiehcarryonthes‘endsauniversalsequence，areusedtoamp

6、lifythespeeifiegenetargets.TheresultingPCRtemPlatesaretailedwiththeuniversalsequences.AsthereaetionProceeds，universalPrimers，Preseniathighconeenirationsinthereaetionmixture，takeovertheamPlifieationProeess.ThetransitionfromusingmanydifferentPrimerstojust

7、twoeffeetively111基于荧光通用引物的多重定量R不PCR基因表达谱分析平台的构建、优化及应用collaPsesthereaetioneomPlexity，asalltheProduetsaretreatedasthesamechemiealsPeeiesandnotdifferentiallyamPlified.ThisteehniqueWascost一effeetive，moderate一throughPut，andreliableinquantifieationofgeneexPre

8、ssion.It15eomPlementarytoeDNAehiP，whiehhasIowquaniitativeaceuraeyandreal一timeqPCRwithlowthroughPut，throughimProvingtheentireProeessofexPressionProfilinganalysis.PreviousstudyhasfoundaQTLsegmeniregulatingmousePubertyonsetonChromos