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1、华支睾吸虫溶血磷脂酶对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的【摘要】目的:观察华支睾吸虫溶血磷脂酶（CslysoPLA）重组蛋白体外对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的作用。方法:应用免疫荧光方法,观察CslysoPLA重组蛋白是否可与大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜结合;应用MTT方法,测定CslysoPLA重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的促增殖作用;应用流式细胞术（FCM）检测CslysoPLA重组蛋白对大鼠卵圆细胞细胞周期的影响。结果:CslysoPLA重组蛋白可与大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜结合,MTT方法测定结果表明低浓度重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞有一定促增殖作用(P<0.0
2、5),20mg/L重组蛋白可促进大鼠卵圆细胞进入G2期,但高浓度重组蛋白可导致大鼠肝星状细胞和卵圆细胞死亡。结论:低浓度的CslysoPLA重组蛋白在体外可刺激大鼠肝星状细胞和卵圆细胞增殖,表明CslysoPLA可能是华支睾吸虫导致胆管上皮增生、腺瘤样病变和肝纤维化的效应分子之一。而高浓度的CslysoPLA重组蛋白可引起肝星状细胞和卵圆细胞死亡,表明CslysoPLA亦可能是华支睾吸虫引起的化学损伤的毒力因子之一。【关键词】华支睾吸虫溶血磷脂酶肝星状细胞卵圆细胞 华支睾吸虫病（clonorchiasis）亦称肝吸虫病,是由华支睾吸虫（Clonorchissinensis,
3、C.sinensis）感染引起的一种食源性人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫寄生于人和其他保虫宿主的肝胆管内,虫体分泌物或代谢产物的化学性刺激及虫体本身的机械性刺激,可引起胆管局限性扩张、胆管上皮细胞增生、管壁增厚、管腔狭窄等病理改变,临床上可诱发胆管炎、胆囊炎、胆管肝炎、肝纤维化甚至肝胆管肿瘤［1］。在感染华支睾吸虫的大鼠模型中,华支睾吸虫合并化学致癌剂20～25周可以诱发大鼠出现肝细胞癌和胆管癌［2,3］。其致癌机制可能是:（1）虫体长期寄生在胆管内,导致胆管上皮细胞增生和脱落,并易继发细菌感染;（2）虫体代谢产物及成虫死亡降解产物所致的化学刺激;（3）与其他因素协同作用,
4、如致癌物以及机体本身的营养、免疫、遗传等因素导致胆管上皮细胞发育不良［4］。虽然流行病学和动物实验结果均表明华支睾吸虫感染是原发性肝胆管癌的病因,但还有很多问题尚未清楚,二者之间的直接因果关系尚未得到证明。目前,有关华支睾吸虫致病机制的了解多源于流行病学调查和临床观察,对其致病机制的研究很有限。因此,对华支睾吸虫的分子致病机制研究,特别是阐明华支睾吸虫感染引起的肝胆管炎症、腺瘤样增生和癌变的分子机制对防治华支睾吸虫病意义非常重大。我们通过基因工程方法获得了华支睾吸虫溶血磷脂酶(LysophospholipaseofClornorchissinensis,CslysoPLA)重
5、组蛋白,并用olecularProbes公司产品;MTT为MBCHEM公司产品;胎牛血清（FCS）为杭州四季青公司产品。大鼠肝卵圆细胞（ovalcell）由中山大学病理学教研室薛玲老师惠赠,实验所用的卵圆细胞为第25～28代。大鼠肝星状细胞（hepaticstellatecell,HSC）由中山大学动物中心提供。 1.2方法 1.2.1CslysoPLA重组蛋白结合大鼠肝星状细胞膜和卵圆细胞膜的免疫细胞化学实验将大鼠肝星状细胞和卵圆细胞分别铺于24孔细胞培养板,37℃培养过夜。用无血清培养液洗涤3次,加入含50mL/L牛血清白蛋白（BSA）的无血清培养液,37℃放置120
6、min。洗涤后,加入CslysoPLA重组蛋白,蛋白终浓度为10mg/L,37℃放置120min。洗涤后,加入用含10mL/LBSA的无血清培养液1∶200稀释的一抗（分别为免疫重组蛋白的大鼠血清,重组蛋白免疫前大鼠的阴性血清［5］）,37℃放置120min。再加入橙红色荧光二抗（1∶400稀释）37℃放置30min。最后加入Hoechst,置荧光显微镜下观察（激发光分别330～385nm和530～550nm）。 1.2.2MTT方法检测大鼠肝星状细胞和卵圆细胞增殖收集细胞,用常规培养液配成单个细胞悬液,细胞计数后稀释至细胞5×107/L,接种于96孔板,置于CO2培养箱,
7、37℃培养过夜。分6组分别加入含2mg/L、20mg/L、200mg/LCslysoPLA重组蛋白的20mL/LFCS培养液,对照组为含20mL/LFCS培养液、含20mg/L和200mg/LSjGST(日本血吸虫谷胱苷肽S转移酶)重组蛋白的20mL/LFCS的培养液。每组做16个平行对照孔,分别于培养12、24、36h,每孔加入适量的5g/LMTT,37℃继续培养3.5h,然后弃尽培养液,每孔加入150μLDMSO,振荡使结晶物充分溶解。选择492nm波长,用全自动酶标仪测定各孔吸光度值,记录结果
