用改良ctab法从吴茱萸不同组织提取基因组dna

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1、用改良CTAB法从吴茱萸不同组织提取基因组DNA吴茱萸是我国传统常用中药材，为芸香科植物吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang和疏毛吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实[1]。贵州省的吴茱萸质量较优，为贵州道地药材，也为贵州名药之一[2]。近代研究证明，其具有镇痛、镇静、抗菌、降压、耐缺氧等药理作用。植物的核基因组的内转录间隔区（in

2、ternaltranscribedspacer,ITS）序列是核基因组中进化较快且序列相对保守的DNA片段，已成为系统与进化研究中的重要分子标记，同时在药用植物的鉴定及道地性方面得到广泛应用[3~5]。吴茱萸品种复杂，不同品种间市场价格差异甚大，种苗在春天落叶后很难区分，传统的分类方法不易鉴别，若建立分子生物学分类方法，得到高质量的DNA是这一技术的的关键。2008年3月开始从吴茱萸的叶和嫩枝中提取基因组DNA，为进行ITS序列测定提供条件。1材料与方法1.1材料1.1.1实验材料于铜仁地区石阡县的石虎吴茱萸及遵义市余庆吴茱萸种植基地的疏毛和大花吴茱萸，均采集新鲜

3、嫩叶及嫩枝，采用干冰保存带回，存于-80℃超低温冰箱。1.1.2试剂2倍溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）提取缓冲液(100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA(pH8.0)，1.4mol/LNaCl)，PVP，β-巯基乙醇，10%SDS，蛋白酶K，氯仿∶异戊醇（24∶1），RNase，3mol/LNaAC。1.1.3仪器梯度PCR扩增仪(德国Eppendorf5330型)，TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，DYY-3A型电泳仪(北京六一仪器厂)，凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。1.2方法分别将新鲜冷冻的嫩叶、枝

4、约0.1g放入已高温灭菌并冷冻过的研钵中，倒入液氮，同时加入适量PVP粉末，研磨成粉末状，移入1.5ml离心管中，离心管中预先加入650μl60℃预热的2倍CTAB抽提缓冲液（内含20μlβ-巯基乙醇，现用现加），35μl10%SDS和20μl20%蛋白酶K，颠倒混匀后60℃恒温水浴箱温浴2h，其间每隔20min颠倒混匀1次。冷却至室温后加相同体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀，至乳浊状后10000/min离心10min，吸取上清液置另一干净1.5ml离心管中，用氯仿-异戊醇（24∶1）抽提2次，每次抽提时间均不少于20min。取上清液，加10μlRNase

5、，室温下静置30min。加1/10体积的醋酸钠，颠倒混匀后加入2倍体积冰预冷的无水乙醇，轻微晃动至出现白色絮状沉淀，用剪过的枪头将沉淀吸出，70%乙醇洗涤3次。室温下晾干后加100μl1倍TE溶解，-20℃保存备用。1.3DNA样品检测1.3.1紫外分光光度计检测将所得DNA样品用TE稀释20倍，紫外可见光分光光度计(TU-1810)测定DNA样品的A260nm和A280nm，以A260/A280比值检测核酸纯度。1.3.2电泳检测取3μlDNA样品，以0.5倍TBE作电泳缓冲液，在含0.5mg/L溴化乙锭(EB)的0.8%琼脂糖凝胶上恒压100V电泳45min，

6、在凝胶成像系统照相观察，检测DNA样品完整性。1.3.3DNA质量检测根据文献[6]设计引物，扩增核基因组的内转录间隔区，引物由上海Sangon公司合成。引物1∶5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；引物2∶5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR扩增体系：5μl的10倍buffer(含25mmol/LMgCl2)；4μl的2.5mmol/LdNTP；1μl的20μmol/L引物1；1μl的20μmol/L的引物2；模板DNA200μg/L；TaqDNA聚合酶2U；ddH2O加至50μl。95℃预变性5min，95℃变性1m

7、in，54℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次，72℃最后一次延伸10min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定成像，恒压100V，电泳30min。2结果2.1紫外分光光度法检测结果从表1可以看出,经紫外分光光度计测定，从3种样品的嫩叶中提取的DNA，在260nm处与280nm处吸光度的比值为1.7~1.9，纯度较高，而嫩树枝中提取的DNA比值为1.3~1.5，含量也较少，说明存在蛋白质等的污染。表1吴茱萸不同样品、不同组织提取的DNA吸光度的比较　　3讨论从吴茱萸中获得高质量的基因组DNA是对其进行分子生物学研究的重要前提。但因多糖、酚等次生物质的存

8、在而影响了