重组鞭毛蛋白cblb502的研制及其在预防免疫性肝损伤中的应用研究

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1、ＴｌＡＭＪＩＭＵＩＶＥＲＳＩＴＹ中国第－所现代大学ＭＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５博学位文￥ｆ一级学科化学工程与技术：学科专业：制药工程作者姓名王晶：杨晓明教授指导教师：天津大学研究生院２０１７年５月重组鞭毛蛋白CBLB502的研制及其在预防免疫性肝损伤中的应用研究ThedevelopmentofrecombinantFlagellinCBLB502anditsapplicationstudiesinpreventingimmune-mediatedliverinjury一级学科：化学工

2、程与技术学科专业：制药工程研究生：王磊指导教师：杨晓明教授天津大学化工学院二零一七年五月摘要肝脏是一个天然免疫器官，独特的双重供血系统使其经常暴露在包括TLRs配体分子（如细菌脂肽/脂蛋白、双链RNA、LPS、Flagellin等）在内的多种肠道微生物组分之中，而TLRs介导的信号通路广泛参与了肝脏炎性疾病的发生和发展。作为唯一一个配体为蛋白质的模式识别受体，TLR5信号通路的活化对电离辐射、化疗药物、氧化应激、移植物抗宿主反应等导致的组织和器官损伤均具有明显的防护作用，而关于TLR5信号通路与肝脏炎性疾病的关系则鲜有报道。本研究

3、制备了一种人为改构的新型TLR5激动剂CBLB502，评价了其介导的免疫调控机制对刀豆蛋白A（ConcanavalinA）诱导的免疫性肝损伤的防治效果，取得的研究结果如下：本文在前期实验室研究工作的基础上，建立了DEAE阴离子交换层析制备CBLB502蛋白的中试发酵和纯化工艺，每批湿菌量在200～240克时，可获得总量约2克、纯度不低于95%的CBLB502蛋白；根据《中国药典》相关要求，对连续三批次制备的CBLB502蛋白原液进行了理化性质、蛋白含量和纯度、生物学活性以及相关物质残留等测定，并进行了方法学研究；确认所制备的CBL

4、B502蛋白各项指标符合《中国药典》中关于重组蛋白药物质量标准的要求并在此基础上拟定了CBLB502蛋白原液的制造和检定标准；通过非人灵长类动物猕猴重度骨髓型急性放射病模型，验证了CBLB502蛋白的辐射防护药效。检测了44例正常人血清样本中CBLB502中和性抗体的水平，初步确定了临床试验入选者中和性抗体水平阈值；制备了用于临床药代动力学用CBLB502特异性单克隆抗体。通过ConA诱导的小鼠急性肝损伤模型，首次发现了CBLB502对免疫因素导致的肝脏损伤具有显著的防治效果。CBLB502预防给药可以明显提高动物的生存质量；显著

5、抑制ConA导致的肝脏组织凋亡和坏死；抑制转氨酶和炎性因子水平上升；抑制炎性免疫细胞的活化和浸润。机制研究结果表明，在ConA肝损伤模型中，CBLB502能够负性调控T/NKT细胞活性并抑制其产生IL-4、TNF-α和IFN-γ等炎性细胞因子，而且对α-Galcer诱导的NKT细胞依赖性的肝损伤表现出类似的抑制效应；应用骨髓嵌合小鼠模型，发现骨髓来源的免疫细胞而非肝实质细胞介导了CBLB502的肝保护效应；CBLB502诱导产生的IL-6可能对其抑炎药效的发挥至关重要，表现为内源性的IL-6被中和后CBLB502的肝保护作用明显减

6、弱。应用tlr5基因敲除小鼠，发现内源性TLR5信号通路缺失会导致小鼠对ConA的敏感性增强，表现为动物生存质量下降；肝脏组织炎性坏死增加；血清炎性因子水平上升以及炎性免疫细胞的活化和浸润增多。以上结果表明CBLB502介导的免疫调控机制对抑制T细胞活化诱导的肝损伤效果显著，具有在临床上防治肝脏炎性疾病的应用潜力。关键词：鞭毛蛋白Toll样受体5免疫性肝损伤T细胞ABSTRACTLiverisaninnateimmuneorganwhichsharesauniquedualbloodsupplyingsystem,therefor

7、e,itwasanatomicallyexposedtovariouskindsofgutbacterialcomponentsincludingTLRsligands(e.g.bacteriallipopeptide/lipoprotein,dsRNA,LPS,andFlagellin)anditisreportedthatTLRs-mediatedsignalingwasextensivelyimplicatedintheonsetandprogressionofinflammatoryliverdiseases.Astheo

8、nlyknownTLRthatsenseaproteinligand,TLR5activationexertedfabulousprotectiveefficacyagainstion-radiation,chemotherapeuticdrugs