NCPP抗肿瘤作用机理及其对免疫性肝损伤的保护作用

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1、山东大学硕士学位论文中文摘要第一部分树突状细胞在NCPP抗肿瘤中的作用目的短小棒状杆菌(CP)制剂是一种非特异性免疫增强剂。大量临床资料显示，CP制剂在治疗癌性胸水、局部注射治疗黑色素瘤、抗病毒、细菌感染以及在治疗免疫功能低下性疾病方面已取得令人兴奋的进展，但副作用较大限制了其迸一步的l盗床应用．若能利用先进技术制备出疗效好、副作用低、应用范围广的新型制剂，必将有着重要的应用价值。无细胞短棒状杆菌制剂(Non-cellCorynebacteriumPatvumProduct，NCPP)是利用纳米技术制备出的一种新型免疫调节剂。树突状细胞(dendriticce

2、ll，DC)是岂今为止人们所发现的体内功能最强的抗原提呈细胞，同时也是可以在体内外直接激活机体初始和特异性免疫应答的唯一细胞。研究表明，DC可以有效地摄取肿瘤抗原，加工处理成抗原肽，然后递呈给效应性T淋巴细胞，发挥特异性的抗肿瘤作用。我们在前期工作中已经证明了NCPP可以激活机体的巨噬细胞(Macrophage，M由)，发挥抗肿瘤作用。如果NCPP亦能够激活机体的DC，那么这将对NCPP抗肿瘤免疫的深入研究起着重要的作用。因此，本论文旨在研究荷瘤小鼠骨髓来源树突状细胞(bonemarrow-derivedDCs，BMDCs)在NCPP抗肿瘤中的作用，对NCPP

3、抗肿瘤免疫机制进行了深入探讨。方法1．NCPP抗肿瘤活性及脾激活作用的检测将B16黑色素瘤细胞悬液接种于C5713I．／6鼠。待聍瘤长至5mmxSmm，将小鼠随机分为B1绷CPP组、B16／cP组、B16，PBS组及PBS组。治疗组腹腔注射NCPP或CP鼠；对照组注射PBS，同时开始测量肿瘤大小，纪录各组小鼠的生存时间，计算生存率，并于注射NCPP或CP后第14天处死小鼠，称量瘤重及体重，评价NCPP的抗肿瘤活性。另将&～uI／c小鼠随机分为3组(NCPP组、CP组及PBS对照组，6只，组)，腹腔注射NCPP或CP，对照组注射等体积的PBS。注射后第14天处死

4、小鼠，分别称体重、脾重、计算脾指数。山东大学硕士学位论文2．NCPP给药后荷瘸小鼠骨髓细胞中DC及M由数量的检测NcPP治疗后第14天，制备荷瘤小鼠骨髓细胞悬液，裂解红细胞后用PBS调浓度为lxl07／ml，FITC-CDllc，PE-MHC-IImAb和PE-F4／80mAb流式抗体4"C避光标记30分钟，PBS洗两次，流式细胞仪检测各类细胞的比例。3．荷瘸小鼠BMDCs的诱导及鉴定各组骨髓细胞以相同的数量种板，诱导培养至第9天，收集各组细胞，调浓度为lxl06／mi，FITC．CDllcmAb，PE．MHC-IImAb标记，流式检测各组BMDC名的诱导情况

5、。剩余细胞种24孔板(5x105／m1)，同时加入LPS(10ug／m1)。3TC，5％C02孵箱中培养48小时后，收集各组细胞，FITC-CD80mAb抗体4"C避光标记30分钟，PBS洗两次，流式细胞仪检测各组细胞CD80的表达情况．4．荷瘸小鼠BMDCs抗原递呈功能检测筒言之，将不同组BMDCs种96孔板(1x105／ml／100u1)，同时加入LPS(10ug／m1)，37℃，5％C02孵箱中培养48小时，加入CD8+T细胞磁珠分选正常C57BI／6小鼠脾脏得到的纯化CD8+T细胞，使得CD8+T与BMDCs的比例为20：1，培养体系内再加入状态良好的

6、B16黑色素瘤细胞，终浓度为5x104／ml。共培养48小时后，应用CCK-8试剂盒检测不同组BMDCs的抗原递呈功能。结果1．NCPP抗肿瘤效应及脾激活作用各组荷瘤鼠肿瘤大小的测量结果显示，与对照组相比，从注射NCPP或CP后第11天起，B16／NCPP和B16／ICP组小鼠黑色素瘤生长速度明显减慢，同一时间点肿瘤体积明显减小(M．01)，但是NCPP和CP组之间没有显著性差异(P>O．05)．脾激活实验的测定结果显示，NCPP和CP组小鼠脾激活明显，脾指数的值与对照组比有统计学意义(P<0．05)，表明NCPP具有与CP相似的抗肿瘤活性和脾激活效应．2．N

7、CPP给药后荷窘小鼠骨髓DCs和M夺的数量变化流式检测结果显示，B16／PBS组小鼠骨髓DCs的阳性率为1．25±0．53％，Bt6／NCPP和B16／CP分别为2．65±0．38％和3．15_+0．25％，表明，与B1卯BS组相比，NCPP或2山东大学硕士学位论文CP处理显著增加了小鼠骨髓DCs和M由的水平(P‘o．05)．3．NCPP给药促进了荷癌鼠成熟DEs协同刺激分子的表达流式检测结果表明，B16／PBS组DCs的阳性率为36．5土1．69％，而B16／NCPP组和B16／CP组BMDC羔的阳性率为分别为59A--蝴．49％和51．3+4．03％，表明

8、，与B16／PBS组相比，NCPP或C