蛋白质分离技术

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1、蛋白质分离纯化的条件蛋Cl质是一类结构复杂的生物人分子，在细胞和抽提液巾蛋D质的性状也不尽相同，离开天然环境，蛋白质分子变得极不稳定，因此从正常牛.物材料屮提取各种蛋白质均需要特定的条件。（一）缓冲液缓冲液可以抗衡蛋a质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋內质的稳定及保证实验的重兌性十分重耍。各种缓冲液原则上都可川于蛋白质的分离纯化,但具体选择何种缓冲液耍视分离纯化的R的物性质及所采用的纯化技术Ifij定,例如缓冲液中的无机成分鱗酸盐、硼酸盐、碳酸盐等）可以勺酶或底物反应，从而影响酶的活性;人多数动物细胞在37°C生理状态下的pH值是7.0-7.5之间，因此应选择相应

2、的缓冲液；对凝胶过滤方法，大多数缓冲液均可适用：离子交换层析中的阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选Tris缓冲液，阳离子交换层析，阴离子缓冲液首选磷酸缓冲液。在选择缓冲液时，敁好对pka相近的一些缓冲液进行比较试验，以避免行的缓冲液与所研究的蛋A质之间发生不&的相互作用，影响蛋白质的分析分离。（二）盐、金域离子和整合剂人多数蛍白质如球®白，在稀盐溶液屮才能溶解，因此应采用含盐（氯化纳）缓冲液=通常用0.1-0.2mol/LNaCI或KCI来模拟生理状态下的离了强度。某些金屈离子特別是二价金屈如Ca2+、Mg2++等往往足酶的组成部分，失去金属离子其活性会人人下降，如果这些确是我们所需要仅护的

3、，则成避免风与缓冲液屮的成分形成复合物。但冇些蛋A质含疏®，而这些疏菽是活性所必须的，为减少金属离了对活性的影响，可以在缓冲液屮加入特异金属离子的螯合剂（Chelate）除去这些金屈离子，如Zn2+的螯合剂为邻二鉍杂菲；Ca24•的螯介剂为乙二醇双（2-氣基乙醚）四乙酸（EGTA）;重金属及它金属离了•为乙二胺四乙酸（EDTA）。（三）还原剂细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎，由于和鉍的接触以及稀释作用而使抗氧化成分减少，导致许多蛋a质被氧化而失去活性，如巯基蛋a，一般应加入一些还原剂。如抗坏血酸、巯葙乙醇、二硫苏糖醇（DTT）可以冇效防止上述的鉍化过程。（叫）去垢剂i•垢剂为双极性分子

4、,nJ•在水屮溶解。除胆酸故外，去垢剂分子通常是由线性或带存分枝的碳鉍化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成。去垢剂的一个重要特性就是N*以形成分了团结构。当膜蛋白与去垢剂分了接触时，膜蛋白的疏水区或穿膜区被去垢剂分子後盖，成簇的去垢剂分子将亲水性失部14外，使其能与水溶性缓冲液相溶。另外，去垢剂形成的微胶粒分子M•对于透析、凝胶过滤层析、非变性电泳都是非常熏要的。为了使蛋ill质更好的溶解和保持蛋a质的活性，需选择合适的去垢剂。如溶解膜蛋a可选择TritonX-100；1-3%浓度的TritonX-100能使许多蛋0质活性保持不变；Tween-20通常川在固相免疫细胞化学反成（如ELI

5、SA、RIA、免疫印迹等）屮用来阻断非特异性蛋ft之间的相互作用；SDS等离了•型去垢剂由于nn史蛋白质以单体形式被分离，常川于蛋內质分子虽的测定：CHAPS常用于离子交换层析和等屯聚焦电泳，含有CHAPS的蛋白质溶液可以冰冻保存。如果用不同的去垢剂均不能获得较好的结果，可以探索多种去垢剂浞合使用。（五）蛋a酶抑制剂破碎细胞提取蛋a质的同吋，会释放出多种蛋a酶，这些蛋白酶需要迅速被抑制才能保持蛋Cl质不被降解。由于人多数蛋G酶的最适pH在3-5或更人，因此可以采川低pH条件降低蛋o酶的活性，但最重要的足加入齿白酶抑制剂。不同类型的蛋白酶可选用不hi］的蛋白酶抑制剂，有吋需要几种蛋白酶抑制剂

6、混合使用。蛋白质的环境因素及保存1、表而效应蛋白质的稀溶液姑丁•使蛋白质失活，这可能是由于玻璃容器表时效应的结災。这一作用可以在溶液中加入高浓度的它蛋白，如牛血淸a蛋Cl（BSA）来防止；为外玻璃表面非特异的吸附町损失大量的纯化蛋白（5cm2的玻璃表面叮吸附1pg蛋白），在溶液中加入BSA也可大大降低这种非特异性的吸附作川。通常在酶活性测定中全:少加入0.1mg/mlBSA,而在蛋白质储存液中则加入10mg/ml的BSA。2、温度除了极少数酶是在低温条件K失活，称为"不耐低温酶”，如线粒体ATP酶，人多数酶在温度高时会失活。蛋白质也一样，在温度超过30-40aC时，蛋白质变得极度不稳定，人

7、多数会由丁热变性而失去活性，蛋白质在低温吋芄半衰期可延长。3、储存蛋D质短期保存（1天吊1周）吋，可以溶液状态在4°C保存。如需长期储存（超过1周），根据需要可以采取不冋的方式，如在硫酸铵溶液屮以沉淀悬浮的方式于4°C保存；或者川硫酸铵沉淀蛋白，离心后在液氮中冷冻，然后低温保存；最好的方法是将蛋D质以冻干的粉末保存。以冰冻干燥的失水状态保存蛋0质对许多蛋D质是有利的，但冻千对于一些蛋白质会部分失去活性。另外，在保存的蛋白