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1、蛋白质的沉淀分离技术摘 要:沉淀分离是经典的化学分离方法，在历史上曾为化学和放射化学的发展作出重大贡献。由于沉淀分离方法简便，实验条件易于满足，再加之近年来一些高选择性的有机沉淀剂和有机共沉淀剂的研究和应用，使传统的沉淀分离方法仍具有旺盛的生命力，被广泛应用于化学工业、食品工业及生化领域中。沉淀分离法可用于常量组分的分离，也可用于痕量组分的富集。工业上应用沉淀技术分离生化产物最典型的例子是蛋白质的分离提取。本文概述了蛋白质处理方面的几种常用沉淀分离技术的基本原理、特点、所用试剂及影响因素等。关键词:蛋白质;
2、沉淀分离技术前言具有生理活性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面已必不可少,在医疗和食品领域已逐渐得到广泛应用。蛋白质具有多种功能性质,每一种特性都会给食品及其加工过程带来特定的效果[1]。一方面,蛋白质作为功能性物质,常存在于复杂的混合体系中,因此,需要将其从原料中分离纯化;另一方面,蛋白质是一种不稳定的有机高分子物质,往往会给生产加工带来不利,故也需要对其进行分离纯化。作为一种应用较早的分离技术,沉淀分离已在蛋白质分离中广泛应用[2]。1 无机沉淀剂沉淀分离法———盐析法[3]1.1 基本原理及特点盐析
3、沉淀是蛋白质和酶提纯工艺中最早采用,且至今仍广泛应用的方法。其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中,随着盐浓度的逐渐增加,由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低,不需要特别设备,操作简单、安全,对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少,缺点是选择性不强。应用实例有大豆异黄酮的提取和大豆蛋白质的分离,其基本工艺流程为:大豆豆粕→乙醇提取→过滤→盐析→离心[2]。1.2 盐的种类及选择蛋白质盐析常采用中性盐,主要有硫酸
4、铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中,应用最广泛的是硫酸铵,其优点有:①溶解度大。25℃时大约每升水可溶解767g硫酸铵,在此溶解度范围内,许多蛋白质和酶都能被盐析沉淀出来;②温度系数小。在低温时,硫酸铵的溶解度受温度影响不大,对于需要在低温条件下进行纯化的酶,有利于保持酶的活性;③硫酸铵不易引起蛋白质变性,对于多种酶还具有保护作用,且价格低廉,来源丰富;④使用后的废液可作为农作物氮肥[4]。缺点:①缓冲能力较小;②硫酸铵中含有氮,因此,影响蛋白质的定量分析,尤其是在采用凯氏定氮法和双缩尿法进行测定时
5、。1.3 盐析法的影响因素①蛋白质种类。不同溶质的盐析常数(Ks)和盐浓度为0时,蛋白质溶解度的对数值(β)均不相同,所需的离子强度也不同;②蛋白质浓度。蛋白质浓度较大时,中性盐的极限沉淀浓度低,共沉作用强,分辨率低,但用盐量少,蛋白质溶解损失小;而蛋白质浓度较小时,情况相反,故一般蛋白质浓度控制在2%～3%为宜;③pH值。当pH值在蛋白质等电点附近时,用盐量少,蛋白质得率高;④温度。温度升高,蛋白质溶解度升高,而多数蛋白质在高盐浓度下,其溶解度反而下降,如胃蛋白酶,但大豆球蛋白例外;⑤离子强度。对于同一类
6、型的蛋白质,随离子强度由低到高的变化,蛋白质也随之发生由盐溶至盐析的变化。对不同类型的蛋白质,盐析时所要求的离子强度不同,一般分离多种蛋白质时采用分步盐析法;⑥离子类型。通常情况下,半径小、带较高电荷的离子盐析效果较好。2 有机沉淀剂的沉淀分离技术2.1 基本原理及特点向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂,降低水的活度,随着有机溶剂浓度的增大,水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低,溶液的介电常数下降,蛋白质分子间的静电引力增大,从而使蛋白质凝聚和沉淀。有机沉淀剂沉淀分离技术的特点是:①
7、选择性较高,即一定浓度的有机溶剂只沉淀分离某一种或某一类组分;②沉淀后所得产品不需脱盐,残留的沉淀剂通过挥发即可除去。而有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用,因而常常需在低温下进行操作。应用实例有高粱蛋白质的提取,其基本工艺流程为:高梁粉→萃取→离心→沉淀→水洗→烘干[5]。2.2 有机沉淀剂有机沉淀剂有乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、异丙酮等,其中最常用的是乙醇和丙酮。蛋白质和酶的沉淀大多采用乙醇,由于甲醇、丙酮均有一定毒性,故使用时必须谨慎。此外,乙醇还可以作为核酸、核甘酸、糖
8、类、氨基酸、果胶等成分的沉淀剂。2.3 有机沉淀剂分离技术的影响因素①蛋白质相对分子质量与有机溶剂用量。一般来说,待分离组分的相对分子质量越小,有机溶剂用量就越多。不同浓度的有机溶剂能使溶质中不同的组分先后沉淀,起到分步沉淀的效果;②温度。有机溶剂存在时,蛋白质溶解度随温度的降低而降低,且蛋白质、酶等对温度变化较为敏感,温度升高时,易发生变性。因此,沉淀蛋白质应尽量采用低温操作;③pH值。蛋白质、酶等大多数属于两
