蛋白质分离技术-层析

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1、亲和层析AffinityChromatography（AC）一、原理生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。酶：基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗原，病毒，细胞DNA：互补DNA或RNA，组蛋白，核酸聚合酶，结合蛋白激素或药物：受体，载体蛋白细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞常见具有专一性亲和力的生物分子对：Somedefinitionsinaf

2、finitychromatographyMatrix(基质或载体):aninertgeltowhichaligandcanbecoupledLigand（配基）:acomponentwhichinteractsspecificallywiththetargetCoupling（偶联）:covalentattachmentoftheligandtothematrixBinding（结合）:associationbetweentheligandandthetarget固相化(Immobilise)MatrixSpecificligand样品固相化再生固相化——将配体以

3、共价键连接于载体上制成亲和吸附剂载体的排斥效应小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基结合载体的空间障碍载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。需加碳氢链“手臂”，长度需适中。二、亲和层析分离过程1、装柱和平衡2、上样、亲和吸附3、洗脱无效洗脱吸附效率不高有效吸附影响吸附的因素1、缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。2、流速尽可能慢，<10ml/cm2.小时3、上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml.4、上样体积取决于亲和力，低则上样量减少，一般柱床体积的5％。洗脱方法（1）非特异性洗脱法：非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等

4、条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。比较经济，较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性。a．当待分离物质与配体亲和力较小时：一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。b．较强时：梯度洗脱，连续改变缓冲液浓度，使洗脱能力逐渐加强c、非常强时：强的酸、碱或加入脲、胍等变性剂使蛋白质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。（2）特异性洗脱法：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱：竞争对配体的结合，这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，

5、配体就会基本被这种物质占据，待分离物质被取代并洗脱。例如：用单糖洗脱与凝集素结合的糖蛋白另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱：已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。再生步骤：起始缓冲液重复平衡一次用高离子强度和低离子强度溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理4、亲和柱的再生：三载体（基质）的选择1、载体要求：有丰富的可供活化的化学基团，并在温和条件下能与配基共价结合。惰性的，非专一性吸附无或足够小。多孔网状结构。良好的机械性能，具有好的液体流动性。有较好的物理和化学稳定性。2、常用载体一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃

6、珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。（1）纤维素优点：来源丰富，可供偶联基团较多，偶联后基团又能突出在载体外缺点：结构不均匀，使偶联上配基浓度不一，非专一性吸附严重用于抗体和酶的纯化（2）葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺优点：化学及物理性质稳定，可用强碱除去非特异吸附杂质。缺点：孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低。（3）多孔玻璃优点：不受微生物的侵蚀，机械强度好，化学稳定性好缺点：但它可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。（4）琼脂糖凝胶非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀

7、适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。商品名：Sepharose型号：2B，4B，6B型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%因为Sepharose4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。四配基的选择1、配体与待分离的物质有适当的亲和力。2、配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。3、配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对配体与待分离物质亲和力没有明显影响。4、配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使

8、用。三、亲