大豆转基因技术及应用研究进展

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所究生课租冷丈课程名称植物基因工程原理授课学期2010学年至2011学年第二学期学院生命科学学院专业生物化学与分子生物学学号2010011138姓名杨文贤任课教师秦新明交稿日期成绩阅读教师签名日期 广西师范大学研宄生学院制大豆转基因技术及应用研宄进展摘要：H前我国已正式批准棉花、西红柿、烟草和牵牛花4种转基因作物进行商业化生产，但真正商业化生产的转基因作物只有棉花，转基因水稻的安全评价己经进入到丫最后阶段。转基因人豆、玉米等转基因作物正处于屮间试验和环境释放试验阶段，进入商业化推广的准备阶段。该文综述我国转基因大豆遗传转化再生体系、遗传转化方法、目的基因类型的研究进展及其产业化现状，并就我国转基因大豆的未来发展前景进行了展望。关键词：大豆转基因转基因技术近年来，由于转基因技术突破了生物物种间遗传物质转移和交换的天然屏障，使人类从对生物的简单认识和利用进入了可以按自己的意愿改造和创造新种质的时代［11。转基因技术打破了常规育的各种局限〃1，并且得到迅猛发展和不断完善，现己成为大豆品质改良育种主要的且最有前途的技术手段［3］。自从世界第一例转基因烟草1983年在美国问世以来，国际上己有30多个国家批准了数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类达40多种。1、大豆遗传转化再生体系研宄目前大豆遗传转化的再生体系主要有不定芽器官发生系统、体细胞胚胎发生系统和原生质体再生系统，其中，以不定芽器官发生途径中的大豆子叶节再生体系的应用最为成熟。1.1不定芽器官发生再生系统大豆不定芽器官发生体系所用的外植体包括无菌苗子叶节、未成熟种子的子叶和茎尖、无菌苗上胚轴、幼胚和小真叶等。不定芽器官发生系统中，外植体内己存在的分生组织和有分化潜力的表皮、亚表皮细胞都可作为遗传转化的靶组织。目前，大豆子叶节不定芽器官发生体系己经被公认为是较成熟、易行的大豆再生体系。周思君等通过大豆幼胚培养诱导器官发生，获得了较高频率的再生植 株［4］。程林梅等以大豆上胚轴、下胚轴、幼胚和小真叶为外植体，较高频率地诱导出再生植株［5］。但不同基因型由于遗传和生理差异，诱导植株再生效果不同。刘博林等从大豆幼胚屮诱导形成体细胞胚胎愈伤组织并分化成苗，建立了一套再生频率较高的大豆植株再生方法l6j。1.2体细胞胚胎发生再生系统诱导外植体胚胎发生，形成体细胞胚，胚萌发发育成为完整植株，这种再生方式称为胚胎发生途径。1983年Christianson等以未成熟胚的胚轴为材料，用改良的MS培养基附加2,4-滴诱导出体细胞胚胎的发生17L1986年Barwale等报道了通过体细胞胚获得植株再生，大豆体细胞胚胎再生体系获得了初步成功,8,oFiner等对体细胞胚胎发生体系做了进一步改进19］。Parrott等首先采用这一体系进行农杆菌介导的大豆遗传转化uni。采用胚性细胞团作为外植体，由于其位于表而，且能在很多位置形成体细胞胚，因此转化筛选都很容易。王晓春等用球形期的体细胞胚作为转基因的受体用于转化，结果表明体细胞胚团有很高的转化率（为8.0%），而发育晚期的子叶胚很难诱导出抗性体细胞胚，转化率为0［11］。大豆体细胞胚胎发生再生系统是目前大豆再生系统研究的一个重要部分，该再生系统有3个显著的优点（1）在1个培养物上所能产生的胚状体数目一般比不定芽数目多；（2）胚状体形成速度快；（3）胚状体结构完整。但是体细胞胚胎发生再生系统也存在部分后代不育、传代时间长、再生植株常出现变异等问题，仍然需要进•-步优化。1.3原生质体再生系统原生质体是基因转移的理想再生体系。在特定条件下，外露使原生质膜确保DNA接触并进入原生质体。该方法不需要任何一种生物载体，而且DNA吸收是直物理过程，从而避免了宿主范围问题。1988年Wei等报道了大豆原生质体再生系统，获得愈伤组织，经诱导成茁，得到了再生植株113j。Dhri等114］和张贤泽等1151对不同的大豆品种进行了试验，也获得了大豆原生质体再生植株。与不定芽器官发生途径和体细胞胚胎发生途径相比，原生质体再生体系具有容易摄取外源遗传物质的优点，从理论上讲克服了大豆遗传转化嵌合体现象。但是实践证明,获得大豆原生质体再生植株十分困难，由于此系统存在操作复杂、工作量大、不 易成功、培养周期过长和容易产生变异等缺点112所以应用并不广泛。2、大豆遗传转化技术研宄随着转基因作物种植而积的日益扩大，遗传转化技术在作物新品种培育、棊因功能研究等领域屮的作用越来越大。应用于大豆育种上的转基因技术方法主要有：农杆菌介异法、花粉管通道法、基因枪法、电击法、PEG转化法、超声波法等。经过多年的实践和优胜劣汰，多数遗传转化方法已被逐步放弃，目前国外大豆的转基因方法主要以农杆菌介导法、基因枪法为主；国内主要是超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法。2.1农杆菌介导法农杆菌介导法是获得第一个转基因植物的方法，迄今为止，农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数85%左右，它己成为植物基因转化的首选方法。农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌，目前与植物基因转化有关的2种类型为：根癌农t十菌（Agrobacteriumtumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes），分别含有Ti质粒和Ri质粒。在植物基因工程屮，利用根瘤农杆菌介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌具有趋化性，侵染受体吋，在植物受伤组织产生的一些糖类和酚类物质诱导下，向受伤组织集中，通过供体和受体特异互作，农杆菌细胞识别并附着到植物细胞表面，将Ti质粒上的一段T2DNA片段导入植物细胞基因组中。农杆菌介导的遗传转化，通常以单拷贝或者低拷贝的形式将外源基因插入到植物基因组，转育周期短、重复性好、基因沉默现象少、组织培养简单|25'271,但是转化和再生受材料基因型限制l28j。2.2基因枪法基因枪法也叫微弹轰击法，是最有希望的基因转移技术之一。在这项技术中，DNA吸附在微载体（钨粉或金粉粒子）表而，然后以高压气体或高压放电为动力，金属微粒被射入受体植物细胞，实施转化。基因枪法最早由美国Cornell大学的Sanford等提出。获得转基因大豆的首例报道在1988年，McCa等用基因枪轰击芽生长点，诱导芽分生组织形成丛生不定芽后再生成完整植株I2L该技术主耍以大豆幼胚的胚轴、茎尖、胚性悬浮细胞和未成熟胚茎尖为转化受体，通 过潮霉素筛选转化植株。基因枪转化法的优点是：（1）不受基因型的限制；（2）产生的微创有利于基因转移，因而具有较高的转化率；（3）能够转移多拷贝的重组DNA或者DNA片段。.其缺点是比农杆菌介导法耗资大，技术难，在植物基因组中拷贝数高，易引起基因沉默等。2.3花粉管通道法将含目的基因的DNA放到授粉后不久经切割的花柱上，DNA沿着花粉管到达胚珠，并进一步整合到胚珠的基因组屮，当携带外源基因的受精卵发育成植株吋，即获得了转基因植物，这就是花粉管通道介导的转化。利用花粉管通道法导入外源基因的方法有子房和胚囊微注射法、柱头滴加法、花粉粒携带法和生殖细胞浸泡法等。花粉管通道法首次用于转化水稻，后来也用于转化其他作物。雷勃钧等|19"2Q|最早在大豆上应用花粉管通道技术进行转基因研究，此后我国许多学者相继开展了这方面的研宄，并育成了抗病丰产品系121"23j。花粉管通道法虽然简便易行，但存在需要育种工作者摸索具体的外源DNA导入时间、方法及后代选择等问题f241。3、转入大豆的外源基因类型大豆中导入的外源基因主要是解决其高产、优质、抗逆和抗病虫等问题。目前，应用于大豆转基因研究的外源基因除gus、nptll、hyg、gfp等标记基因和报告基因外，还涉及以下几种：抗除草剂、抗病毒、抗虫、抗逆境、品质（脂肪、蛋白、生物活性物质）改良、雄性不育、改变花形和花色等。我国转基因人豆的研究多是围绕对转基因植株进行抗性标记筛选、PCR检测、Southern杂交和部分抗性基因的功能检测开展的，研究广度和深度不够。不仅缺乏具有自主知识产权的载体和像Bt和EPSP基因一样具有重大应用前景的基因，而且基因转化和筛选效率较低所转化的外源基因多为单个基因，今后转入双价抗虫（或抗病）基因是大豆转基因的一个方向。3.1抗除草剂基因抗除草剂基因的研究是目前大豆转基因研究中最成功的，它往往是与光谱高效除草剂的研宄相结合的，利用的基因主耍有二类，一类是可以改变除草剂靶物敏感性的基因，另一类是除草剂解毒基因，包括来自农杆菌的CP4EPSPS、pat 和psbA基因等。目前应用面积较大的是抗草甘膦除草剂的转基因大豆品种，其次是抗草铵膦品种，此外还有抗磺酰脲类除草剂（绿磺隆、氯嘧磺隆等）品种。由于草甘膦具有高效、安全、无残留、杀草谱广的突出优点，使种植者大大地降低了除草成本，而获得丰厚的经济效益。国外通过基因枪转化获得的抗草铵膦转基因大豆新品种A-27-04-14、A5547-127分别含2个、1个pat基因，1997年经营养、环境安全评价后申请进入商业化生产［44］。我国获得的转基因抗阿特拉津大豆，是我国最早的转基因抗除草剂作物|451。3.2抗虫基因大豆抗虫转基因研究涉及到来自苏云金杆菌的Bt基因和豇豆胰蛋白酶基因。徐香玲等『221以Ti质粒为介导，将Pkt54B7C5质粒上的B、t、KS内毒素蛋白基因导入东北大豆“黑农37”、“黑农39”等品种；郭三堆等［46］将构建成的带有CryIA和Cpti2个基因的pGB14ABC植物高效表达载体，通过花粉管通道法，获得了有较好抗虫能力的再生植株；苏彦辉等147］用Bt基因和GUS基因通过基因枪和根癌土壤杆菌介导转入主栽大豆品种中获得了再生植株；高越峰等1481利用RT-PCR方法扩增出大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因单一目的片段DNA并成功克隆且转化到烟草中去，获得了具有明显抗棉铃虫能力的转基因烟草。3.3抗病基因抗病基因研究主要是病毒外壳蛋白（viruscoatprotein）基因和几丁质酶基因。近年来，人们己相继克隆了SMVCP基因、NIB基因、NIA基因，并构建植物表达载体Rsm124等转化土壤农杆菌，获得转基因大豆（或烟草）植株；徐香玲等利用农杆菌介导法将几丁质酶基因导入东农37号、吉林28号大豆中用于抗大豆真菌病害的研究；刘德璞等通过花粉管介导法，将具有高抗花叶病的外源DNA导入大豆基因组中获得抗SMV的大豆新品系。3.4抗逆境基因H前已分离出大量与抗逆代谢相关的基因，包括与抗（耐）寒有关的脯氨酸合成酶基因、鱼抗冻蛋白（AFP）基因、拟南芥叶绿体32磷酸甘汕酰基转移酶基因，与抗旱有关的茧蜜糖合成酶基因及一些植物去饱和酶基因等。屮国在抗逆基 因的分离、克隆和转化等方面的研究己取得一定进展，克隆了耐盐碱相关基因，但多运用在烟草、番茄、小麦、玉米等作物上，在大豆上鲜有报道。3.5品质基因改良分子生物学的迅速发展，使转猜因作物（GeneticallyModifiedOrganismCrops）正从以改善作物间接性状（抗除草剂、抗病、抗虫、抗逆等）为主的第1代向以改善品质特性（营养组成和含量等）为主的第2代转换。品质改良主要涉及蛋白质的含量、氨基酸的组成、淀粉和其它多糖化合物以及脂类化合物的组成。富含蛋氨酸的转基因烟草、直链淀粉含量降低的转基因水稻、月桂酸含量高达40%的转基因油菜都相继成功，有的己进入大田试验。应用生物技术改良大豆脂肪酸组成就是人豆基因工程育种的成功范例，目前商业化的有关品质改良的转基因大豆已有高油酸大豆和高硬脂酸转基因大豆。最近国外转△2脂肪酸脱氢酶基因(FAD221)基因大S及其它相关rfii质基因的改良研究正在深入，有的晶种己获推广并开始大面积、种植。国内的李明春等将从高山被孢霉(Mortierellaalpina)中分离出的A6脂肪酸脱氢酶基因成功转化，获得了高丫2亚麻酸含量的转基因大豆。刘兰英等将构建35S启动子和水稻10KD富硫醇溶蛋白基因双拷贝的表达载体PBIN-OKEM,利用根癌农杆菌介导法转化大豆子叶、子叶节，将目的基因整合到大豆基因组中。4、展望目前，我国己初步建立了转基因生物安全管理技术体系，制订了一系列法规、规范和标准，为转基因大豆环境和食用安全的检测、监测以及大豆产品转基因成分提供了可靠的技术规范和标准。我国己获得一批具有自主知识产权的关键基因，逐步优化了大豆遗传转化体系，获得了一批具有潜在应用价值的转基因材料，建立了安全评价和检测监测技术体系。中国大豆产业应和其它主要农作物一样，大力加强大豆转基因生物技术的研发，早日创造出具有中国特色和自主产权的、已建立高效、稳定的大豆遗传转化受体系统的安全的转基因大豆。发展转基因大豆有利于改革耕作制度，降低生产成本，提高种植效益，对于提升我国大豆产业的市场竞争力、保障国家粮食安全、促进农民增收具有重要意义。虽然抗病毒基因工程取得了巨大的进步，许多重要作物也以转基因为手段获得了抗病毒植株， 并且培育出抗病毒新品种。但是大豆抗病毒基因工程进展还是非常缓慢，至今只有儿例成功的报道，而且未见通过基因工程培育的抗病毒大豆品种在实践中应用的报道。抗病毒转基因大豆的研宄任重道远，仍然需要在优化受体系统、提高转化率、培育稳定遗传的种质等方面做大量的工作。参考文献：[1]张兆熙.转基因技术的研究综述及利弊关系[J].科技创业，2006(11):1112112.[2]杨桂英，马绍宾，何瀚.大豆的遗传特点、品质改良与育种难点[J].贵州农业科学，2002,30(6):57260.[3]CahoonEB.Geneticenhancementofsoybeanoilforindustrialuses:Prospectsandchallenges[J].AgBioForum,2003,6(1&2):11213.[4]陈云昭，王玉国.大豆外植体培养再生植株的研究[J].山四农业大学学报(自然科学版)，1983(1):41245[51程林梅，孙毅，刘少翔，等.大豆不同外楨体楨株再生的研究[J1.中国油料作物学报，1998,20(2):24225.[6]周思君，尹光初，雷勃钧，等.从大豆幼胚诱导器官发生再生植株[J].大豆科学，1990,9(4):2852290.[7]王升吉，吴元华，王洪岩，等.大豆不同外植体组织培养及再生研宄[J].沈阳农业大学学报，1999,30(3):2552259.[8]ChristiansonML,WarinckDA,CarlsonPS.Amorphogeneticcompetentsoybeansuspensionculture[J].Science,1983,222:6322634.[9]LazzeriPA,HildebrandDF,CollinsGB.Aprocedureforplantregenerationfromimmaturecotyledontissueofsoybean[J].PlantMolecularBiologyReports,1985,3:1602167.[10]LazzeriPA,HildebrandDF,CollinsGB.Soybeansomaticembryogenesis:Effectsofhormonesandculturemanipulations[J].PlantCellTissueandOrganCulture,1987,10:1972208.[11]LeeW,KomatsudaT,OkaS.ComparisonofembryogenesisefficiencyoneightportionsimmatureembryosinGlycinegz^czfofJl.SoybeanGeneticsNewsletter,1990,17:59261.[12]FinerKR,FinerJJ.UseofAgrobacteriumexpressinggreenfluorescentproteintoevaluatecolonizationofsonication2assistedAgrobacterium2mediatedtransformation2treatedsoybeancotyledons[J].LettersinAppliedMicrobiology,2000,30:4062410.[13]刘博林，徐民新.两个栽培大豆品种的体细胞胚胎发生和植株再生的研究[J].屮国油料作物学报，1999,21(2):11213.[14]王萍，吴颖，杨武杰，等.大豆未成熟子叶体细胞胚胎发生及其相关因子的分析[J].中W油料作物学报，2002,24(1):29232.r151李海燕，朱延明，冯莹莹，等.大豆幼胚子叶胚性悬浮细胞系的建立与次生胚诱导[J].大豆科学，2002,21(2):1232126.[16]王晓春，王罡，季静.农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化影响因子的研究[J].大豆科学,2005,24(1):21226. 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