人granzyme b基因在hela细胞中的表达

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1、人granzymeB基因在HeLa细胞中的表达摘要:目的构建携带人granzymeB基因的真核表达载体，并将其在HeLa细胞中表达.方法用反转录PCR获取人granzymeB全长cDNA序列，将其活性型序列克隆进pcD-NA3重组表达质粒.脂质体法转染HeLa细胞，间接免疫荧光检测目的蛋白表达，HE染色观察其对转染HeLa细胞形态的影响.结果成功获得了野生型granzymeBcDNA，构建了编码活性型granzymeB的真核表达载体pcDNA3-G.转染HeLa细胞后观察到目的蛋白表达，转染细胞形态发生变

2、化，出现多核大细胞及固缩小细胞.结论活性型granzymeB哺乳动物表达系统的建立，为进一步研究granzymeB的生物学效应奠定了基础.　　KeyeB;geneexpression;HeLacells　　Abstract:AIMToconstructeukaryoticexpressionvectorcarryinghumangranzymeBgeneandexpressitinHeLacells.METHODSRT-PCRangranzymeBcDNA.Thentherebinantexpressio

3、nvector　pcDNA3-GeBintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.AftertransfectionintoHeLacellsthroughlipofectamine2000TM，theexpressionoftargetgenemunofluorescenceas-sayanditseffectonHeLacellsangranzymeBcDNAeBetransfectedcellsgreultiplenuclei，.CONCLUSIONTheestablis

4、hmentofmammalianexpressionsystemofactivegranzymeBisofsignificanceinfurtherresearchforgranzymeB.　　0引言　　granzymeB，即颗粒酶B，是杀伤性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞颗粒（granule）中最重要的丝氨酸蛋白酶，在颗粒介导的靶细胞凋亡中起关键作用［1，2］.它最初以酶原形式合成，在内质网中加工除去N端信号肽后，贮存于CTL的颗粒中.当CTL接受抗原刺激时，granzymeB被切除N端酸性

5、二肽，成为活性型granzymeB［3］.活性型granzymeB通过穿孔素或受体进入靶细胞，广泛切割含Asp-X，Glu-X位点的多种底物蛋白，引起细胞凋亡［4-8］.目前对其促凋亡功能的研究局限于纯化granzymeB天然或重组蛋白，或分离表达granzymeB的CTL，体外与靶细胞孵育.我们克隆获得了人granzymeB全长cDNA序列，并将活性型序列转染HeLa细胞，观察表达产物对转染细胞的直接效应.　　1材料和方法　　1.1材料pUC19质粒、pcDNA3质粒、E.coliDH5α宿主菌和人宫颈

6、癌细胞系HeLa均为本室保存;淋巴细胞分离液为华美公司产品;PHA-P购自Sigma公司;限制性内切酶、Taq酶、反转录试剂盒、RPMI1640，DMEM，新生牛血清及脂质体lipofec-tamine2000TM均购自Gibco公司;T4DNA连接酶为TaKaRa产品;plasmidpurificationkit购自上海华舜公司;山羊抗人granzymeB多克隆抗体为SantaCruz产品;生物素化兔抗山羊二抗及SABC-Cy3为博士德产品;测序试剂盒购自PE公司.　　1.2方法　　1.2.1人gran

7、zymeBcDNA的获取及克隆用淋巴细胞分离液分离健康人外周血单个核细胞，0.015gL-1PHA-P刺激培养72h，加Trizol试剂提取总RNA.设计引物GRBF，GRBR，序列如下.GRBF为:5’-TTTGGATCCATGCAACCAATCCTGCT-TCT-3’;GRBR为:5’-TTTGAATTCTTAGTA-GCGTTTCATGGTTT-3’.以GRBR为引物，按试剂盒说明书反转录出cDNA第一链，用GRBF和GRBR引物PCR得到granzymeB双链cDNA.BamHI，EcoRI双酶切

8、PCR产物及pUC19质粒，连接、转化入E.coliDH5α，酶切鉴定后测序，重组克隆质粒命名为pUC19-GrB.　　1.2.2活性型granzymeB基因的真核表达载体构建设计引物GF和GR，GF为:5’-TTTGAATTC-ATGATCATCGGGGGACATGAGGC-3’;GR为:5’-TTTTCTAGAGGATCCTTAGTAGCGTTTC-ATGGTTTT-3’.以pUC19-GrB为模板，PCR获得除去N端信号