人bnip3基因在hela细胞中的表达及定位

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1、人BNIP3基因在Hela细胞中的表达及定位作者：陈登宇刘芸钟田雨王蔚赵明哲刘靖华姜勇【摘要】目的：构建BNIP3-HA融合蛋白的真核表达载体，观察BNIP3在Hela细胞中表达及其定位。方法：采用两步克隆法将HA和BNIP3的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上，随后转染Hela细胞。BNIP3经AlexaFluor488免疫荧光标记，线粒体用MitoFluorRed589染色后在荧光显微镜下观察BNIP3的表达和定位。结果：重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定构建正确，并在Hela细胞中能够表达，在荧光显微镜下观察，BNIP3-HA融合蛋白

2、分布于线粒体。结论：成功构建BNIP3-HA融合蛋白表达载体并在Hela细胞线粒体中表达。【关键词】基因，bcl-2；Hela细胞；线粒体；荧光免疫测定；细胞内定位［Abstract］Objective:ToconstructhumanBNIP3fuseproteinvector,expressitinHelacells,anddetermineitslocationinthecells.Methods:TheexpressionvectorwasconstructedbycloningthecodingsequencesoffusionproteinofhumanB

3、NIP3andHAontovectorpcDNA3bytwo-stepmethod;TheconstructedvectorwasthentransfectedintoHelacellsand9observedwithfluorescencemicroscope.Therecombinantplasmidwasverifiedbyenzymedigestion,polymerasechainreaction(PCR)andsequenceanalysis.Results:ThefusionproteinwashighlyexpressedinHelacells.Bei

4、ngobservedwithfluorescencemicroscopy,thefusionproteinofhumanBNIP3andHAwasfoundtodistributeinthemitochondria.Conclusion:TheexpressionvectorofBNIP3fusingtoHAissuccessfullyconstructedandthefusionproteinhasexpressedinthemitochondriaofHelacells,whichwouldfacilitatethefurtherstudyofBNIP3.［Key

5、words］genes,bcl-2;helacells;mitochondria;fluoroimmunoassay;intracellularlocalizationBNIP3作为bcl-2家族中促凋亡成员，在肿瘤的缺氧凋亡和免疫耐受的研究中有着非常重要的意义[1]。以往的研究发现，BNIP3促进细胞凋亡主要是通过线粒体凋亡途径完成的。但BNIP3的线粒体膜转位及其促细胞凋亡机制尚不清楚[1]。构建带有HA标签的BNIP3真核表达载体，并通过细胞免疫荧光技术观察了该蛋白在人Hela细胞线粒体中的定位情况，试图为探讨BNIP3蛋白在不同细胞类型中的表达和亚细胞定位，及

6、其与线粒体内其他蛋白质的相互作用奠定基础。1材料和方法91.1主要材料　　克隆载体pcDNA3购自Clontech公司；大肠杆菌DH5α及人Hela细胞系均为本室保存；PolyFect转染试剂购自Qiagen公司;小鼠HA单克隆抗体购自CellSignaling公司；羊抗鼠IgG（H+L）AlexaFluor488、MitoFluorRed589和DAPI细胞核染色试剂购自MolecularProbes公司；DMEM培养基购自Gibco-BRL公司;胎牛血清（FBS）购自HyClone公司;微量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自U-gene公司;限制性核酸内切酶Kpn

7、I、EcoRI、XbaI、BamHI、Ligationhigh试剂、高保真DNA聚合酶Kodplus和Kodplus突变试剂盒购自ToYoBo公司;引物由北京英骏公司合成；1kb、500bpDNAMarker购自NEB公司；琼脂糖和LB培养基购自LifeTechnology公司；其他试剂为国产分析纯。1.2pcDNA3-BNIP3-HA融合蛋白真核表达载体的构建构建流程见图1。设计分别含有HA序列片段的上下游引物,将HA编码序列插入质粒pcDNA3的多克隆位点中的XbaI和ApaI之间，上游引物为5′ccagattacgcttaagggccctatt