日本脑炎病毒糖蛋白模拟短肽的筛选和基因定位

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1、日本脑炎病毒糖蛋白模拟短肽的筛选和基因定位　　摘要:目的寻找JEVmAb2F2识别的抗原表位，为JEV小分子多肽疫苗合理设计提供依据.方法链亲和素包被塑料平皿，加入生物素标记2F2与噬菌体随机15肽库，再洗脱，扩大培养进行三轮淘筛，经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后，挑取10个阳性克隆，DNA测序，与JEVE蛋白同源分析.结果筛选到的噬菌体能特异地与2F2结合，并且这种结合可被天然抗原所抑制.10个克隆的氨基酸序列相同:-HTPQToscreentheepitopeofJapaneseencephali-tisvirus（JEV）mAb2F2inordertoassisti

2、nthedesignofthepeptidevaccineagainstJEV.METHODSTheplasmiddisherpeptidelibraryplified.Afterthreeroundsbiopanning，theposi-tiveclonesinoacidsequencesof10positiveclonesinoacidsequencesof10positiveclonesologyanalysis，onehigherhomologoussequencesightbeaminotopeofJEVEprotein.　　0引言　　日本脑炎病毒（Japanesee

3、ncephalitisvirus，JEV）引起的流行性乙型脑炎（乙脑），是一种严重的急性中枢神经系统传染病，主要在东南亚等地区流行.采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施.目前国内外使用的乙脑疫苗尚不理想，如出现不良反应和有毒力逆转的可能性，乙脑新型疫苗研制势在必行.但对JEV抗原表位认识的不足影响了乙脑新型疫苗的研制.噬菌体表面呈现技术（phagedisplay）和随机肽库技术（randompeptidelibrary，RPL）提供了深入研究病毒抗原表位的可能［1］.JEV囊膜糖蛋白E是病毒表面主要的结构蛋白与诱导保护性免疫的主要成分［2］.本实验用高中和活性抗JEVE

4、蛋白的鼠mAb2F2淘筛噬菌体随机15肽库，以期找出这株mAb识别的抗原表位，为JEV小分子多肽疫苗合理设计提供依据.　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1X15（15肽库）由Australia的YipYL教授惠赠，随机多样性1.3×109，测序引物5’-CTGAA-GAGAGTCAAAAGC-3’，宿主菌K91kana.　　1.1.2链霉亲和素（SV）和生物素酯（NHS-biotin）购自Sigma公司.　　1.1.3HRP-antiM13mAb为Pharmacia产品.　　1.1.4噬菌体单链DNA提取试剂盒为上海华舜公司产品.　　1.1.5抗原纯化的JEV鼠脑抗原（

5、JEVAg）及正常鼠脑抗原为本室制备［3］.　　1.2方法　　1.2.1mAb的纯化和标记抗JEVE蛋白的鼠mAb2F2为本室制备［4］，具有种特异性及高中和活性，IgG2a类.常规方法制备单抗腹水，辛酸-硫酸铵法提取IgG，经DEAE-SepharoseFF离子交换柱纯化后标记生物素.　　1.2.2淘筛噬菌体随机肽库SV包被35mm塑料平皿，BSA封闭后，TBST振洗6次，同时生物素标记mAb与肽库4℃反应过夜，加入平皿.室温轻摇10min，TBST振洗10次，加入甘氨酸-盐酸（pH2.2）洗脱液，室温轻摇10min，收集洗脱液，加1molTris-HCl（pH9.1）中和，

6、测定洗脱物噬菌体滴度，计算投入产出比，扩增噬菌体并测滴度，取一半用于下一轮淘筛［5］.按上述方法淘筛三轮，各轮mAb用量分别为15μg，1.5μg，0.2μg.　　1.2.3夹心ELISA检测噬菌体2F2（100mgL-1）包被酶标板，BSA封闭后，加入第三轮淘筛扩增的噬菌体及阴性对照15肽库，1010TU/孔，室温振摇1h，加HRP-antiM13mAb，室温振摇1h，OPD显色，测A490nm值.包被时设无关mAb，分别为2H4，CHA9，A4，及无关蛋白BSA和SV，包被浓度均为100mgL-1.　　1.2.4竞争ELISA检测噬菌体2F2（100mgL-1）包被酶标板，

7、BSA封闭，不同浓度JEVAg与第三轮淘筛扩增的噬菌体（1010TU）混合物加入包被孔内，室温振摇1h，加HRP-antiM13mAb，室温振摇1h，OPD显色，测A490nm值.另外，阴性对照为不同浓度正常鼠脑抗原与第三轮淘筛扩增噬菌体（1010TU）混合物，阳性对照为第三轮淘筛扩增的噬菌体（1010TU）.　　1.2.5挑选噬菌体阳性克隆及DNA序列测定第三轮淘筛的洗脱物感染宿主菌，铺平板，随机挑取20个克隆，扩大培养并测滴度，用上述夹心ELISA方法检测20个克隆与2F2的结合特性.挑