人巨细胞病毒潜伏激活感染诊断的进展_1课件

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1、免疫组织化学技术IHCT—Immunohistochemistrytechnique定义：在组织细胞原位，通过抗原/抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标志物，对被检测抗原/抗体进行定性、定位和定量检测的免疫学测定技术。特点：结免疫学反应特异性和组织化学可见性为一体；借助先为显微镜放大，于细胞或亚细胞水平测定抗原/抗体。1免疫组织化学技术类型：酶免疫组化技术荧光免疫组化技术免疫电镜技术亲和免疫组化技术（标记物等的不同）实例：2阳性患者阴性患者自制E－二抗(1:100)商品E－二抗(1:200)3图20伊文氏蓝复染效果图A.阳性标本检测效果

2、B.阴性标本检测效果C.阳性标本复染后的效果D.阴性标本复染后的效果ABCD4一、免疫组化技术介绍（一）标本制作（二）抗体的选择（三）抗原/抗体反应（四）改善标本的通透性（五）对照项的设立（六）检测结果的判断5（一）标本制作标本—指固定在玻片上用作为抗原的，如组织、细胞或微生物。6标本的类型—组织切片、印片、涂片。1.印片法：优点：操作简单，抗原保存好缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背景染色。72.组织切片组织切片---冷冻切片/石蜡切片介绍：特点：组织新鲜、速冻，恒温冷冻切片机片厚5～10μm，-20℃保存；后者只要求固定的标本，经脱

3、水+浸蜡包埋常温切片机，片厚2～3μm～优点：前者抗原丢失少，结构保证完好；后者片薄观察结构清晰，宜连续性可作回顾性研究。缺点：前者细胞清晰度差，现用难保留；后者抗原量少，易出现非特异着色，需前处理。81).切片前的准备工作(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶。9(2)切片粘合剂的种类多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片→丙酮5min→APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔

4、包好，室温或4℃保存备用。10切片要求及注意事项：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)52－60℃烤片18h。(3)切片厚2～4μm。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片）11标本的固定标本固定需达到目的：细胞内蛋白凝固终止胞内酶活性保持细胞固有态除干扰性类脂等理想固定剂：能快速固定细胞抗原防止抗原物质扩散固定后抗原的特性不改变例：10%中性福尔马林液、丙酮、乙醇12标本的保存（温度、时间）1.冷冻保存：2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管中，-80℃冻存。3.蜡块的保存4.活细胞的保存可根据需要将细胞直

5、接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。13标本的预处理（目的、注意点）为什么要进行酶消化和抗原修复？醛键形成羧甲基形成甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。14抗原修复(AntigenRetrieval;AR)1酶消化(1)原理：1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白2)断交联(2)蛋白酶的种类15胰蛋白酶0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1NNaoH调pH至7.

6、8。消化时间37℃30min。胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1NHCI稀释，消化时间37℃30～180min。蛋白酶K20μg/ml，用pH8.00.5MTris-HCI配制，消化时间37℃20～40min。链酶蛋白酶0.1%，用pH7.4,0.5MTris-Hcl稀释，消化时间37℃1～4h。无花果蛋白酶0.1%浓度，用0.2MpH7.4PBS稀释，消化时间37℃30～60min。16（二）抗体的选择第一抗体（一抗）：高特异性、高效价、多克隆。高特异性—针对性强，靶的明朗高效价—稳定性好，反应时间长；适宜稀释可减少干扰。多克隆（动物免疫血

7、清）—针对多为点，易检出。17市售抗体的种类某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋白酶有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性18标记抗体在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶金属离子：胶体金颗粒标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低19抗体的保存商品化一抗或自制一抗均需加入防

8、腐剂，在4℃中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可10μl/支分装，标上号，-40℃保存备用。抗体的配制20抗体最佳稀释度的测定直接测定法一抗稀释度特