2013浙科版选修1第四部分《实验十三 dna片段的pcr扩增》word学案

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1、DNA片段的PCR扩增PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。一、PCR反应组分PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：细胞内DNA复制条件分析：条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶DNA聚合酶催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物一小段单链DNA或RNA为DNA聚合酶提供合成的3’端起点PCR反应体系10xBuffer5μLM

2、gCl2（25mM）5μLdNTP(2.5mM)1μL上游引物(10pmol)1μL下游引物(10pmol)1μLTaq酶（5u/μL）0.5μL模板DNA1μLddH2O35.5μLTotal50μL二、PCR的反应过程PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。1.变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。2.

3、复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3.延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。循环数变性复性延伸第一次94°C，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次72℃，10min三、PCR产物的检测教材中用分光光度计检测DNA含量，个人认为不如电泳检测法。因为分光光度计检测法，只能说明DNA含量增加了，没有电泳检测法形象、直观、经济。琼脂糖凝胶电泳步骤如下：（1）

4、用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。（2）配制浓度为1%（1g/100mL）的琼脂糖凝胶。在锥形瓶中，称取一定量的琼脂糖粉，加入适量蒸馏水，在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60℃，倒入电泳槽中，待其凝固。（3）配制1倍的TAE电泳缓冲液100mL。（4）向电泳槽中缓缓倒入配制好的电泳缓冲液，以没过胶面2mm为宜。小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。如果样品孔内有气泡，应设法除去。（5）在DNA样品中加入相当于样品0.2倍体积的载样缓冲液（10×baffer），混匀后，加入样品孔内。（6）接通电源。一般红色代表正极，黑色代表负极。D

5、NA样品是由负极向正极移动，因此要保证靠近加样孔一端的电极为负极。电压为1～50V/cm(长度以两个电极之间的距离计算)。（7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。一般200～400个核苷酸长度的PCR产物，在50V电压下，电泳20～40min即可。（8）将凝胶放入溴化乙锭溶液（EB）中染色后，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。四、PCR操作演示现场实际操作，已做过预实验。边操作变讲解。注意事项：1PCR各反应成分的用量（不同材料、不同目的，用量均有差异。其中Taq酶、dNTP的用量很关键）；2.PCR反应程序设置（退火温度是主要影响因

6、子）。五、PCR的常见问题1.假阴性，不出现扩增条带　　1）模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。　　2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是

7、PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。　　

8、4）Mg2+浓度：Mg2