靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制

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1、靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制作者：李凡王小毅田甜陈力李佳任国胜【摘要】目的：采用RNA干扰技术下调Livin基因的表达，观察其提高乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性及机制.方法：构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDAMB231后，通过实时定量PCR，WesternBlot技术检测干扰前后Livin和Caspase3的表达；采用MTT法检测细胞增殖的变化以及细胞对阿霉素的半数抑制浓度，流式细胞法检测细胞周期，TUNEL法检测其诱导细胞对阿霉素化疗增敏

2、作用，并观察细胞超微结构变化.结果：成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体，siLivin2对Livin的mRNA和蛋白抑制效率最高，分别为%和%，同时Caspase3的mRNA和蛋白表达升高约%和%.siLivin2转染4h后，与未转染组相比，细胞增殖活力受到抑制，siLivin2联合阿霉素使细胞周期阻滞于G0/G1期，显著提高了细胞对阿霉素敏感性，其凋亡率达到(±)%，IC50降低为mg/L，差异具有统计学意义.透射电镜下可见细胞胞质浓缩，染色质聚集为小团块，电子密度增高.结论：靶向Livinsi

3、RNA真核表达载体可以有效地下调MDAMB231细胞Livin基因的表达，并且通过上调Caspase3的表达抑制细胞增殖，显著增强其对阿霉素的敏感性.【关键词】乳腺肿瘤；Livin基因；RNA干扰；阿霉素0引言Livin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotEin，IAP)家族的新成员，它在肿瘤组织中特异性表达并具有强大的抗凋亡作用，已成为肿瘤基因治疗新的靶点［1］.近年的研究［2］认为，凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，IAP家族在调节肿瘤细胞对凋亡敏感性方面起着核心作用.而特异性阻

4、断肿瘤细胞内高表达的Livin基因，可以抑制细胞增殖并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［3］，但其化疗增敏作用的发生机制尚不明确.我们通过构建靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDAMB231，观察Livin表达下调对细胞阿霉素化疗敏感性的影响，并探讨其发生的可能机制.1材料和方法材料人乳腺癌细胞株MDAMB231；shRNA质粒载体pGeneSil1；LipofectamineTMXX；质粒提取试剂盒；总RNA提取试剂、实时定量PCR扩增试剂；兔抗人多克隆抗体Livin；兔抗人多克隆抗体Caspas

5、e3，辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体；TUNEL检测试剂盒.方法靶向Livin的siRNA真核表达载体的构建利用Ambion公司在线设计程序，针对GenBank中Livin的共同序列，筛选出三条干扰序列，即siRNA1：5′CTGGCCTCCTTCTATGACT3′；siRNA2：5′GGAAGAGACTTTGTCCACA3′；siRNA3：5′CCGTGTCCATCGTCTTTGT3′；同时设计非特异性靶序列：5′GACTTCATAAGGCGCATGC3′.将化学合成的正义链和反义链退火，与经HindⅢ和

6、BamHⅠ酶切后线性化的pGeneSil1载体连接，经筛选，酶切鉴定后测序.所得质粒命名为siLivin1,siLivin2,siLivin3和siHK.MB231细胞的培养和转染MDAMB231细胞用含100mL/L胎牛血清、1×10U/L青霉素和1×10U/L链霉素的RPMI1640培养液，于37℃，50mL/LCO2的恒温箱中培养传代.转染前将细胞接种于6孔板,待细胞生长至密度为70%～90%时，按照LipofectamineTMXX说明书转染重组质粒.实时定量PCR检测细胞接种于6孔板，分为未转染组，s

7、iHK组，脂质体组，siLivin1组，siLivin2组和siLivin3组.转染4h后收集细胞，按照试剂说明书提取细胞总RNA.以cDNA为模板，进行实时定量PCR反应.PCR扩增条件：95℃10s,1个循环；95℃s，60℃1s，40个循环；95℃1s,60℃0s,95℃1s,1个循环.引物序列：Livin，上游：5′CTGGGACCCGTGGGAAGAAC3′，下游：5′TCCTGGGCACTTTCAGACTG3′；βactin，上游：5′TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA3′，下游

8、：5′GTAGCCACGCTCGGTCAGGATCTTC3′.以Livin基因与βactin相对浓度的比值反映Livin表达量.检测Caspase3时，实验分为未转染组，siHK组和干扰Livin效果最强的siLivin2组.引物Caspase3,