靶向livin的sirna提高mdamb231细胞对阿霉素敏感性的可能机制论文

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1、靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制论文李凡王小毅田甜陈力李佳任国胜【摘要】目的：采用RNA干扰技术下调Livin基因的表达，观察其提高乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性及机制.方法：构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDAMB231后，通过实时定量PCR，TT法检测细胞增殖的变化以及细胞对阿霉素的半数抑制浓度（IC50），流式细胞法检测细胞周期，TUNEL法检测其诱导细胞对阿霉素化疗增敏作用，并观察细胞超微结构变化.结果：成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRN

2、A表达载体.freelRNA和蛋白抑制效率最高，分别为76.4%和70.2%，同时Caspase3的mRNA和蛋白表达升高约157.1%和38.6%（P0.05）.siLivin2转染48h后，与未转染组相比，细胞增殖活力受到抑制，siLivin2联合阿霉素使细胞周期阻滞于G0/G1期（P0.05），显著提高了细胞对阿霉素敏感性，其凋亡率达到(38.35±2.64)%，IC50降低为（2.46±0.87）mg/L，差异具有统计学意义（P0.05）.透射电镜下可见细胞胞质浓缩，染色质聚集为小团块，电子密度增高.结论：靶向LivinsiR

3、NA真核表达载体可以有效地下调MDAMB231细胞Livin基因的表达，并且通过上调Caspase3的表达抑制细胞增殖，显著增强其对阿霉素的敏感性.【关键词】乳腺肿瘤；Livin基因；RNA干扰；阿霉素0引言Livin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族的新成员，它在肿瘤组织中特异性表达并具有强大的抗凋亡作用，已成为肿瘤基因治疗新的靶点［1］.近年的研究［2］认为，凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，IAP家族在调节肿瘤细胞对凋亡敏感性方面起着核心作用.而特异性阻断肿瘤细胞内高

4、表达的Livin基因，可以抑制细胞增殖并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［3］，但其化疗增敏作用的发生机制尚不明确.我们通过构建靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDAMB231，观察Livin表达下调对细胞阿霉素化疗敏感性的影响，并探讨其发生的可能机制.1材料和方法1.1材料人乳腺癌细胞株MDAMB231（中科院上海细胞资源中心）；shRNA质粒载体pGeneSil1（武汉晶赛公司）；LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；质粒提取试剂盒（美国Omega公司）；总RNA提取试剂、

5、实时定量PCR扩增试剂（大连TaKaRa公司）；兔抗人多克隆抗体Livin（美国Imgenex公司）；兔抗人多克隆抗体Caspase3，辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司）；TUNEL检测试剂盒（德国Roche公司）.1.2方法1.2.1靶向Livin的siRNA真核表达载体的构建利用Ambion公司在线设计程序，针对GenBank中Livin（No.NM022161，No.NM139317）的共同序列，筛选出三条干扰序列，即siRNA1：5′CTGGCCTCCTTCTATGACT3′；siRNA2：5′

6、GGAAGAGACTTTGTCCACA3′；siRNA3：5′CCGTGTCCATCGTCTTTGT3′；同时设计非特异性靶序列：5′GACTTCATAAGGCGCATGC3′.将化学合成的正义链和反义链退火，与经HindⅢ和BamHⅠ酶切后线性化的pGeneSil1载体连接，经筛选，酶切鉴定后测序.所得质粒命名为siLivin1,siLivin2,siLivin3和siHK.1.2.2MDAMB231细胞的培养和转染MDAMB231细胞用含100mL/L胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L链霉素

7、的RPMI1640培养液，于37℃，50mL/LCO2的恒温箱中培养传代.转染前将细胞接种于6孔板,待细胞生长至密度为70%～90%时，按照LipofectamineTM2000说明书转染重组质粒.1.2.3实时定量PCR检测细胞接种于6孔板，分为未转染组，siHK组，脂质体组，siLivin1组，siLivin2组和siLivin3组.转染48h后收集细胞，按照试剂说明书提取细胞总RNA.以cDNA为模板，进行实时定量PCR反应.PCR扩增条件：95℃10s,1个循环；95℃5s，60℃31s，40个循环；95℃15s,60℃60

8、s,95℃15s,1个循环.引物序列：Livin，上游：5′CTGGGACCCGTGGGAAGAAC3′，下游：5′TCCTGGGCACTTTCAGACTG3′；βac