猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

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1、猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究唐先春1,吴斌1*,索绪峰2,王大林2,陈焕春1,尹争艳1（1.华中农业大学动物病原微生物实验室,武汉430070）（2.海口市美兰区罗牛山兽医站,海南571133）摘要:用PCR方法配合生化鉴定，从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressiveatrophicrhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(Pasteurelamultocida,Pm)。然后做了药敏试验，并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测,用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌（ToxigenicPasteu

2、rellamultocida,T+Pm）进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致；PCR分型表明有46株为D型Pm，18株为A型Pm，1株为B型Pm，1株无法定型；有8株用PCR检测为T+Pm；豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T+Pm的进一步鉴定，也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8株T+Pm都为D型，都分离于有严重PAR症状的猪。关键词:多杀性巴氏杆菌；产毒多杀性巴氏杆菌；PCR；分型；药敏试验中图分类号:S852.61+2文献标识码:A文章编号:0366-6964(2005)0多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida,Pm）是一种重要的病原，可以导致

3、猪肺疫、牛羊出败、禽霍乱等危害严重的畜禽传染病。产毒多杀性巴氏杆菌（ToxigenicPasteurellamultocida,T+Pm）是猪进行性萎缩性鼻炎(Progressiveatrophicrhinitis,PAR)的主要病原菌。该病是养猪业的一种重要传染病，其主要表现为：慢性鼻炎、颜面部变形、鼻甲骨萎缩或由于经常打喷嚏而造成鼻出血。哺乳仔猪感染本病后，除引起鼻甲骨甚至鼻腔变形、萎缩或消失外，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓、饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡。育肥猪感染本病后，呼吸道的正常结构和功能遭到损害，致使机体抵抗力降低，极易感染其它病原，诸

4、如支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副嗜血杆菌、猪流感病毒、猪生殖—呼吸道综合征病毒等，引起猪呼吸道综合征，增加猪的死亡率[1～4]。多杀性巴氏杆菌按荚膜的不同可分为A、B、D、E、F5个血清型。研究表明，T+Pm主要是D型Pm，而且T+Pm主要分离于具有严重PAR症状的猪，从有肺炎症状猪分离的Pm一般是不产毒素的[5,6]。T+Pm与T-Pm在形态特征及生化反应特性上没有区别。与PAR密切相关的T+Pm产生一种约145kDa的皮肤坏死毒素（Dermonecrotictoxin,DNT），该毒素由toxA基因编码。一般认为T-Pm不会导致PAR，而提纯的DNT可以导致PAR的发生[7～9]。所以

5、，DNT是诊断及控制PAR的关键，也是区分T+Pm与T-Pm的关键。基于DNT的特性，已经建立了一些检测方法，以区分T+Pm与T-Pm，如豚鼠皮肤坏死试验、小鼠致死试验[10]、细胞促生长试验、胎牛肺细胞毒性试验[11]、ELISA[5]。但这些毒素检测方法，无论是动物试验还是细胞培养，操作繁琐，费时费力，在临床上的应用都有很大的局限性[5]。随着T+Pm毒素基因的分子生物学研究，以及近年来PCR检测方法的广泛应用，使T+Pm的检测越来越简便、灵敏和完善。1材料与方法1.1酶及主要试剂收稿日期：2004-04-05基金项目：国家自然科学基金项目资助（30471292）作者简介：唐先春（1

6、978-），男，汉，湖北十堰人，硕士，主要从事产毒素多杀性巴氏杆菌方面研究，E-mail:xianchuntang@tom.com。*通讯作者Tel:027-87288629TaqDNA聚合酶购自TaKaRa；生化鉴定管及药敏试纸购于杭州天和微生物试剂有限公司。1.2病原菌的分离病料来源于海南、湖北、湖南、广东、广西、上海等十多个省市。对于有明显鼻萎缩症状的猪，鼻盘消毒后采其鼻拭子；部分病料是送检的无鼻萎缩症状的猪以及病肺，无菌采其肺组织。将采集的病料划线接种于胰蛋白大豆琼脂（TrypticSoyAgar，TSA）平皿，37℃培养18～24h后观察，挑取直径1～2mm、透明、光滑、湿润的

7、菌落进行革兰氏及瑞氏染色。革兰氏染色呈红色的细小球杆菌，瑞氏染色呈两极浓染的细菌为可疑菌落，对其传代纯化，进一步做生化及PCR鉴定。1.3生化鉴定对于纯化好的可疑菌落按使用说明做以下生化实验：葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、吲哚、MR、VP、硝酸盐还原，并接种于麦康凯培养基。1.4药敏试验已纯化好的Pm，挑取单菌落接种与脑心浸液（BrainandHeartInfusion,BHI）培养基，培养14h。比浊法记数后，用BH