猪肠道抗PEDV乳酸菌株筛选及其体外抗病毒作用

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、全日制硕士专业学位（毕业）论文猪肠道抗PEDV乳酸菌株筛选及其体外抗病毒作用学位申请人：郑常龙指导教师：左玉柱副教授学位名称：兽医硕士研究领域：不区分研究领域授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月三日 分类号：S855.3单位代码：100861密级：公开学号：20169200793猪肠道抗PEDV乳酸菌株筛选及其体外抗病毒作用ScreeningofLactobacillusfromSwineIntestinesandTheirAntiviralActivitiesAgainstPEDV学位申请人：郑常龙指导教师：左玉柱副教授学位名称：兽医硕士研究领域：不区分研究领域授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月三日 摘要乳酸菌在医药、农业及食品等行业发挥着重要的作用，其安全性已经受到认可。猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）对仔猪的致死率极高，对养猪业有极大的经济损失，PEDV的防治成为养猪行业的一大难题。为从仔猪粪便中分离得到抗猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）的乳酸菌，本研究先用MRS培养基对乳酸菌进行了初步的分离与纯化，再将得到的乳酸菌通过MTT比色法、TCID50法、间接免疫荧光法在体外细胞模型上对乳酸菌的抗病毒效果进行评价，从中得到3株抑制病毒的益生菌株。本试验为乳酸菌抗病毒作用的进一步研究奠定了基础。试验利用MRS培养基先从猪粪便中分离出36株具有益生菌特性的菌株。然后通过MTT比色法初步筛选出具有抗病毒作用的10株乳酸菌。对分离的10株乳酸菌进行体外的耐酸耐胆盐试验，从中选出6株作为备用菌种。对6株菌进行生化试验以及16SrDNA鉴定得出4株为植物乳杆菌，1株粪场球菌，1株戊糖片球菌，选其中三株菌进行进一步抗病毒试验。将分离鉴定的菌株进行体外的抗病毒试验。首先利用MTT法计算出3株菌的最大无毒剂量，以此为起点将其进行稀释成不同浓度进行试验。试验在体外Vero细胞上进行。乳酸菌或其代谢产物通过三种方式（先加入乳酸菌或代谢产物后加入病毒；乳酸菌或者代谢产物和病毒同时加入；先加入病毒再加入乳酸菌或代谢产物）来评估PEDV对细胞的抑制作用。结果表明三种方式中有着不同的抑制效果，活菌试验中，乳酸菌预先处理组抑制率较好，代谢产物试验中，同时接入代谢产物和病毒组对PEDV抑制效果要比其他两组抑制效果好。将PEDV与乳酸菌共培养，然后检测病毒的TCID50，结果显示通过乳酸菌处理后的TCID-3.76-3.82-3.1550/100μL分别为10、10、10，与对照组未经过处理组病毒TCID-4.1650/100μL（10）作对比，均有不同程度的降低，说明了乳酸菌对病毒的毒力具有显著的抑制作用。利用间接免疫荧光法检测乳酸菌处理细胞后再感染病毒的效果，同时设立病毒与空白对照。通过观察荧光的数量来判定乳酸菌的抑制作用。结果很明显，加入乳酸菌及其代谢产物的处理组荧光数量比病毒对照组均有不同程度的降低，说明乳酸菌和代谢产物对PEDV吸附细胞具有一定的阻断作用。综上所述，本试验从猪粪便中成功分离并筛选出3株具有抗PEDV作用的乳酸菌，它们的菌体及代谢产物可以降低病毒对细胞活力影响，阻断PEDV对细胞的感染。关键词：乳酸菌；猪流行性腹泻病毒；分离鉴定；抗病毒 ScreeningofLactobacillusfromSwineIntestinesandTheirAntiviralActivitiesAgainstPEDVAuthor:ZhengChanglongAdvisor:AssociateProfessorZuoYuzhuMajor:VeterinaryMedicineAbstractLacticacidbacteriaplayanimportantroleinmedicine,agricultureandfood,theirsafetyhasbeenrecognized.Porcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)hasahighmortalityrateforpigletsandhasgreateconomiclossestothepigindustry.ThepreventionandtreatmentofPEDVhasbecomeamajorproblemforthepigindustry.ToisolateLactobacillusfromPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)frompigletfeces,thisstudyfirstlyusedMRSmediumtoseparateandpurifyLactobacillus,andthentheanti-viraleffectsoflacticacidbacteriawereevaluatedonthecellmodelinvitrousingMTTcolorimetricassay,theTCID50method,indirectimmunofluorescenceassay,andthreeprobioticstrainsthatinhibitedtheviruswereobtained.Thisexperimentlaidthefoundationforfurtherresearchontheantiviraleffectoflacticacidbacteria.Inthisexperiment,36strainswithprobioticcharacteristicswerefirstisolatedfromswinefecesusingMRSmedium.Then10strainsoflacticacidbacteriawithantiviraleffectwereinitiallyscreenedbyMTTcolorimetry.Theisolated10strainsoflacticacidbacteria（LAB）weresubjectedtoangallbladderresistancetestinvitroacid,and6strainswereselectedassparestrains.AccordingtoBiochemicaltestsand16SrDNAidentificationof6strains,4strainsofLactobacillusplantarum,1strainofFacalisand1strainofPediococcuspentosaceuswereconfirmed.Threestrainsofbacteriawereselectedforfurtherantiviraltesting.Isolatedandidentifiedstrainsweresubjectedtovitroforantiviraltests.First,theMTTmethodwasusedtocalculatethemaximumnon-toxicdosesofthethreestrains.Thestartingpointwastodilutethemtodifferentconcentrationsfortesting.TheassaywasperformedonVerocellsinvitro.LABortheirmetabolitesareassessedinthreeways(firstaddingLABormetabolitesfollowedbyviruses;LABormetabolitesandvirusesaddedsimultaneously;firstaddingvirusesandthenaddingLABormetabolites)toassessPEDV'sinhibitionofcellseffect.Theresultsshowedthatthereweredifferentinhibitioneffectsinthethreemodes.Inthelivebacteriatest,theinhibitionrateofthepretreatmentgroupwasbetter.Inthemetabolitetest,thesimultaneousaccesstothemetabolitesandthevirusgrouphadagreaterinhibitoryeffectonPEDVthantheothertwogroups.Theeffectisgood. Co-cultivationofPEDVwithlacticacidbacteriaanddetectionoftheTCID50ofthevirusshowedthattheTCID-3.76-3.8250/100μLaftertreatmentwithprobioticswere10,10,and10-3.15,respectively,andtheTCID50/100μLoftheuntreatedgroupcomparedwiththecontrolgroup(10-4.16)forcomparison,allhavedifferentdegreesofreduction,indicatingthatlacticacidbacteriahaveasignificantinhibitoryeffectonthevirulenceofthevirus.TheindirectimmunofluorescenceassaywasusedtotesttheeffectoftheLABtreatmentofthecellsandtheinfectionofthevirus,andtheviruswasestablishedwithablankcontrol.TheinhibitionofLABwasdeterminedbyobservingtheamountoffluorescence.TheresultsshowedthattheamountoffluorescenceinthetreatedgroupwithLABandtheirmetaboliteswaslowerthanthatintheviruscontrolgroup,indicatingthatLABandmetaboliteshadacertainblockingeffectonPEDV-adsorbedcells.Insummary,thisexperimentsuccessfullyisolatedandscreenedoutthreestrainsoflacticacidbacteriawithanti-PEDVeffectfrompigfeces.TheirbacterialandmetabolitescanreducetheeffectofvirusoncellviabilityandblockPEDV'sinfectionofcells.Keywords:Lacticacidbacteria;Porcineepidemicdiarrheavirus;Isolationandidentification;Antiviral 缩略词表Abbreviationsandacronyms英文缩写英文全称中文全称PED（V）Porcineepidemicdiarrhea(virus)猪流行性腹泻（病毒）TGE（V）Transmissblegastroenteritis(virus)猪传染性胃肠炎（病毒）mLMilliter毫升minMinute分钟dKilodalton千道尔顿sSecond秒mgMilligram毫克μgmicrogram微克hHour小时ODOpticaldensity光密度PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液r/minRevolutionsperminute每分钟转数mol/LMole/litter摩尔/升μLMicroliter微升LLiter升RT-PCRReversetranscription-PCR逆转录-PCRIgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GHRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶TrisTrishydroxymethhylaminomethane三羧甲基氨基甲烷DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜ODOpticaldensity光密度CPECytopathogencityeffect细胞病变NBSNewbornbovineserum新生牛血清 目录1引言........................................................................................................................................................11.1益生菌概述.................................................................................................................................11.1.1益生菌定义和作用..........................................................................................................11.1.2益生菌的分类..................................................................................................................11.1.3益生菌所具有的特性......................................................................................................21.2益生菌抗病毒效果在肠道内的研究进展..................................................................................31.3肠道益生菌抗病毒作用机制研究进展......................................................................................51.4PEDV的概述..............................................................................................................................51.4.1病原学..............................................................................................................................61.4.2流行特点..........................................................................................................................61.4.3致病机制..........................................................................................................................61.4.4PEDV的防治...................................................................................................................61.5研究的目的与意义.....................................................................................................................72材料和方法............................................................................................................................................82.1毒株及粪样的来源.....................................................................................................................82.2主要试剂.....................................................................................................................................82.3培养基及用液.............................................................................................................................82.3.1细胞培养用液..................................................................................................................82.3.2培养基和溶液..................................................................................................................92.4主要仪器设备.............................................................................................................................92.5乳酸菌的分离纯化...................................................................................................................102.6PEDV的增殖与检测................................................................................................................102.6.1Vero细胞的复苏...........................................................................................................102.6.2PEDV的增殖传代.........................................................................................................102.6.3细胞毒的冻存与收集...................................................................................................102.6.4病毒RNA的提取..........................................................................................................102.6.5病毒cDNA的合成........................................................................................................112.6.6病毒基因的扩增............................................................................................................112.7PEDV毒力的测定....................................................................................................................122.8抗PEDV乳酸菌的初步筛选...................................................................................................122.9乳酸菌的耐酸耐胆盐试验.......................................................................................................122.9.1耐酸试验.......................................................................................................................122.9.2耐胆盐试验...................................................................................................................122.10乳酸菌株的初步鉴定.............................................................................................................12 2.10.1初筛乳酸菌株的生化鉴定...........................................................................................122.10.2初筛乳酸菌株16SrDNA鉴定....................................................................................132.11乳酸菌体外抗PEDV作用.....................................................................................................142.11.1乳酸菌株生长曲线的测定...........................................................................................142.11.2乳酸菌菌液及代谢产物的制备...................................................................................142.11.3乳酸菌的细胞毒性测定...............................................................................................142.11.4PEDV多克隆抗体的制备...........................................................................................152.11.5MTT法间接检测益生菌对病毒的抑制率..................................................................152.11.6PEDV毒力受乳酸菌的影响.......................................................................................152.11.7间接免疫荧光检测PEDV在Vero细胞上受到乳酸菌的影响................................163结果.......................................................................................................................................................173.1乳酸菌的分离纯化....................................................................................................................173.1.1菌落形态.........................................................................................................................173.1.2PEDV的增殖与检测结果.............................................................................................173.1.3PEDVRT-PCR鉴定......................................................................................................183.1.4PEDV的TCID50测定....................................................................................................183.1.5抗PEDV乳酸菌株筛选结果........................................................................................193.2初筛菌株的鉴定........................................................................................................................203.2.1生化鉴定结果.................................................................................................................203.2.216SrDNA鉴定结果.......................................................................................................223.2.316SrDNA同源性分析及进化树建立...........................................................................223.3乳酸菌体外抗PEDV作用结果...............................................................................................233.3.1生长曲线的测定.............................................................................................................233.3.2乳酸菌对细胞毒性的测定结果.....................................................................................243.3.3MTT法测定结果............................................................................................................243.3.4乳酸菌对PEDV毒力的影响........................................................................................293.3.5间接免疫荧光结果分析.................................................................................................294讨论.......................................................................................................................................................314.1抗PEDV乳酸菌的分离鉴定及初筛过程................................................................................314.2乳酸菌体外抗PEDV作用分析...............................................................................................314.2.1MTT法检测抗PEDV作用的分析...............................................................................324.2.2TCID50检测乳酸菌对PEDV毒力影响的分析............................................................344.2.3间接免疫荧光法检测乳酸菌抗PEDV作用的分析.....................................................345结论.......................................................................................................................................................36参考文献..................................................................................................................................................37作者简介..................................................................................................................................................43致谢........................................................................................................................................................44 1引言1.1益生菌概述1.1.1益生菌定义和作用在中文文献中，益生菌有多种叫法，比如益生素、促生素，亦有活菌制剂、微生态制剂的叫法。益生菌的英文名probiotics一词是希腊语“forlive”派生而来，意思是“为了生命”。抗生素（antibiotics）是其反义词与之相对立。Lilly和Stillwell最早提出了关于益生菌的现代定义：有促进其他的微生物生长作用，即与抗生素作用相反的有益微生物[1]。早在20世纪中叶，很多国家就开始制定一系列禁用抗生素的法律法规来应对日趋泛滥的抗生素滥用，以此来减少抗生素所带来的负面影响。在此后的一段时间内，为了找到抗生素的替代品来满足庞大的需求，科学界逐渐发现了益生菌的妙用。1974年，Parker提出“益生菌是能够使得宿主肠道菌群保持平衡的微生物或物质”[2]；到1989年，国外科学家Fulle在其著作中称“益生菌只是局限于活的微生物制剂的范围内，它的功能是能改善肠道内的菌群生态平衡”。1992年，Havenaar等人对微生物定义做了进一步的补充“通过改善肠道内源微生物，对动物或人类施加有益影响的单一或者混合的微生物”。经过长时间的研究，人们发现，活菌及其代谢产物在生理功能上几乎作用一致，Arameo在90年代重新定义了益生菌：“活菌或者死菌被摄入宿主体内后可以改善粘膜表面微生物群或酶的平衡，或体内免疫机制得到激发而增强机体抵抗力的微生物制剂”。随着生物技术的发展，微生物学家，免疫学家，营养学家都越来越关注益生菌对动物和人类健康的积极影响，益生菌的定义日趋完善，形成了目前较为共识的定义：适量的益生菌摄入有助于改善宿主的微生态，具有生理活性的活菌的益处就在于此。乳酸菌是目前已发现的对人和动物最安全的一类益生菌，它们在生理活动中产生一系列的抗菌物质，这类物质诸如有机酸、H[3]。大多数的乳2O2以及细菌素等，能促进宿主的生理活动作用酸菌是益生性的，在宿主的机体受到病毒、病原等有害物质攻击时，通过唤醒免疫系统来对宿主的机体起到保护作用[4]。到目前为止，益生类乳酸菌就能在某些情况之下产生抗病毒作用，如引发腹泻的轮状病毒[5]。一些研究指出，口服型的益生菌可以促进免疫系统的免疫作用，然后排出促炎细胞因子[6]。1.1.2益生菌的分类益生菌的来源比较多，但主要的途径是动物肠道，通过正常的生理性菌以及肠道外的细菌产生。虽然其种类比较多，但多数都有同一个常见的作用，即能分泌淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等辅助功能的活性酶，这些活性的物质在分解、吸收和转化食物营养方面已被证实效果显著。除此以外，其促生作用和增强免疫系统活性方面也是效果较好[7]。在畜牧业领域，乳酸菌、部分杆菌以及常用到的酵母，在饲料和医药上应用广泛。1 1.1.2.1乳酸菌乳酸菌是一类细菌的总称，目前已发现的有18个属200余种，以其历史的悠久，发展的速度快著称，主要用于发酵糖类。作为肠道内的生理菌群，这类细菌在微氧或厌氧条件也可以进行正常的生理活动，故此有着良好的促生长作用。特别是在调节肠胃等消化道的功能上，效果显著，其作用是通过整合消化道有益菌群、改善微生态平衡来实现的。乳酸菌在改善消化系统的功能、降低胆固醇、促进杀死体内的毒素、提高免疫系统活性中起到重要的作用。在肉鸡饲养领域，经过大量的研究表明，这类细菌的作用效果受很多因素的影响，比如消化道的菌群分布状况，消化道的结构、有机体的发育状况以及免疫系统活性等。但是乳酸菌不同的产物的作用效果也不一样，例如菌粉和菌液在控制大肠埃希菌的数量上有着不同程度的抑制作用[8]。1.1.2.2双歧杆菌1899年，法国科学家Tissier在其实验中发现，经过母乳的喂养后，婴儿的排泄物中存在一类厌氧杆菌，厌氧且呈阳性，末端可见分叉，Tissier将这种细菌命名为双歧杆菌（Bifidobacterium）。截至目前为止，这类细菌已有32个种，其活菌、菌体碎片以及分泌物都有促生长的作用，特别是在改善消化道功能方面[9]。1.1.2.3芽孢杆菌总的来说，芽孢杆菌是好氧型菌，但是在缺氧的条件下也能存活，是革兰氏阳性菌的一种。这种细菌在提高生物的活性方面效果显著，能在正常状况之下分泌大量的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等。因为其环境适应力强，能适应较高温度的环境但是在动物肠道内分布不多，是目前效果最好的微生物添加剂。2005年，邝哲师及其团队在研究中发现，仔猪断奶后数天，在其饲料中添加芽孢杆菌制剂，实验进行到两周后，相较于对照组，猪仔的消化道内蛋白酶活性大大提高，甚至达到了60%，淀粉酶活性也有一定程度的改善，可以达到21.30%，其他类型的活性酶比如胃蛋白酶、胰淀粉酶也提高55.68%、23.05%，效果十分显著[10]。2004年，霍军及其研究团队也做了一个类似的实验，只是此次实验的分析对象为肥育猪，实验结果显示：饲料中添加了芽孢杆菌制剂的一组实验对象日增重更高[11]。1.1.2.4酵母菌酵母菌在人们的日常生活中应用广泛，在酿造业、食物的发酵以及饮料的发酵上也同样应用广泛。但是这一类细菌很少出现在动物肠道中，因为酵母菌是一类需氧菌，而且喜欢在多糖偏酸的环境。在实际应用中，酵母菌的益生作用主要体现在促进宿主机体的瘤胃发酵、促进脂肪酸的挥发，使纤维素降解。此外，酵母菌体内还含有大量的蛋白质、核酸以及很多种类的益生酶等，这些物质可以使动物更好的吸收摄入的营养。通过以上作用，对于提高牧场饲料利用率，减少牲畜的出栏周期，增加牧场收益，节约成本等大有益处。1.1.3益生菌所具有的特性由于益生菌在保障人体健康方面作用显著，所以开发更多的多源流、多功能的益生菌越来越有必要，而且这已经成为国际性的热门研究课题。在其筛选标准上，目前最为主要的还是参照其生理和功能等重要特点。2 黏附性：益生菌可以进行正常的生理活动，就必须能黏附在动物的肠道内壁，这就需要益生菌作用于肠黏膜表面，然后再结合于黏附素受体以达到黏附的效果。但是这是具有竞争性的，每一个益生菌占据了固定的位置后，就会通过自身的能力定值于这一处，其他的益生菌就不会再定位于此处，从而增强免疫系统的活性[12]。除此之外，这些有益的作用是有时间限制的，一旦黏附的细菌死亡后，肠道内壁就会产生新的黏附结合体，从而再次达到新的结合[13]。因此，益生菌的黏附能力及特性是影响该制剂作用效果最主要的因素。存活性：由于胃肠道属于缺氧的环境，益生菌能在其上皮细胞中进行正常的生理代谢，才能在动物体内产生益生的效果[14]。如果益生菌死亡，或者数量达不到一定的量，其益生效果也是不可能实现的。益生菌能存活的条件是：能经受得住胃酸、胆汁盐以及其他环境恶劣的消化液的考验，而且要求较长的存活时间，还要能形成一定数量的菌落。功能性：如果生物体内出现一定数量的致病菌，益生菌就会在其在体内产生有机酸、细菌素、H[15]。2O2等有效抑制或者杀死病菌的物质，并且能对这些病菌产生拮抗作用，提高机体的免疫能力增强免疫性：在一些特殊的情况下，宿主的免疫系统对于病菌的入侵反应滞后，益生菌可以提醒宿主的免疫反应能力。例如，激活巨噬细胞来增强杀菌效果[16]。临床功效性：必须经过临床验证，才能证明该类型的益生菌有益健康。可加工性：要达到使用效果，益生菌就应当能稳定地遗传，而且能保持较高的活性，还要能实现批量化的工业生产[17]。1.2益生菌抗病毒效果在肠道内的研究进展大量的研究表明，虽然益生菌只是肠道菌群的少数，但是是对于宿主健康最重要的一类细菌。乳酸杆菌能调节细胞免疫能力，在益生菌医疗方法中最为常见是一类重要的有益型双歧杆菌。这类细菌对其宿主还有很多好处，比如提高机体抗病毒活性。科学家目前在其抗病毒性感冒、RV甚至是艾滋病毒等方面的研究日趋成熟。为了找到更多的益生菌使用方法，科学家开展了很多次的实验。MAEDA等人以小鼠为实验对象，喂其失去活性的LactobacillusplantarumL-137。一段时间后，将H1N1病毒滴在实验对象的鼻子处，与对照组小鼠进行对比后，发现实验组抗病毒能力更高。因此，我们可以得出这样的结论：灭活的LactobacillusplantarumL-137任然具有抗H1N1病毒的效果[18]。在YASUI及其团队的实验中，同样以小鼠为实验对象，并喂食其含有短双歧杆菌的饲料，结果发现其体内IgG含量较对照组高，说明短双歧杆菌及其产物有抑制流感病毒的功效，该实验第一次证实了益生菌在呼吸道的抗病毒作用[19]。在VRESE设计的实验中，通过双盲法试验，结果证实：益生菌可以减少普通感冒的发病概率以及得病后的恢复周期[20]。经实验证明，型号为DN114001的干酪乳杆菌对腹泻具有保护作用，在无菌条件下，每隔一段时间分多个小组用发酵乳喂食小鼠后，发现越早食用发酵乳的小鼠腹泻症状越轻[21]。在TAO所设计的实验中，发现了2株特殊的乳酸菌，与HIV病毒结合后，在一些特殊的区域比如gp120中，可以实现对HIV感染能力的抑制[22]。除了可以提高HIV感染者的肠道性能来提高免疫效果，还能产生抗HIV蛋白，这对HIV病毒患者绝对是一个好消息。RAO等人通过实验发现，HIV病毒某些可以穿过宿主细胞膜的蛋白，在其C2末端3 的522aa序列上，摄入经过试验改造的大肠埃希菌Nissle1917。结果显示：HIV进入靶细胞受阻，极大的减缓了HIV繁殖，也证实了该微生物剂可以产生抗HIV肽[23]。英文名简称为LAB的乳酸菌是最常使用到的益生菌之一[24]。它兼有抗菌作用和抗病毒作用，在对疾病的防治领域使用广泛[25,26]。实验证明，嗜酸乳杆菌不但具有明显的免疫系统刺激性，也能很好的促进猪轮状病毒疫苗的作用[27,28]。猪仔感染PRRS后，使用口服型的酸乳杆菌试剂也能快速增重[29]。在实践中发现，为了提高断奶仔猪的食欲，达到快速增重的效果，可以喂食其含益生菌混合物的饲料，以此减少仔猪断奶后发生的腹泻概率，并且能较大程度的接近断奶前的增重效果。故此，我们可以得知，乳酸菌混合物对断奶仔猪有很好的效果[30]。随着研究的深入，在抗病毒领域有越来越多的结果得到证实，但是益生菌的抗病毒机制仍然没有得到统一的结果，但是值得一提的是，在益生菌与被病毒攻击的宿主的研究问题上，科学界引入了细胞模型。在2007的一个实验研究中，在猪的小肠上皮细胞注入非致瘤性病毒，同时在以肺泡巨噬细胞的模型中，研究者通过研究口炎在水泡病毒的感染下的发病状况发现，益生菌及其代谢物对这种病毒的致病性有抑制作用。此次实验非常成功，首次于细胞模型中得到益生菌及其代谢产物有抑制病毒活性的效用[31]。对于双歧杆菌的益生机制以及作用效果的研究，黄鸿眉及其研究团队有着夯实的实验证明。实验利用轮状病来摄入到肠上皮细胞，该实验同样是在生物体外完成的。病毒感染HT-29的过程中，发现IL-8、TNF-α在肠上皮细胞被RV作用的情况下能分泌出很多种大量病毒抑制物，诸如IL-8、TNF-α等（中文名为致炎性细胞因子），细胞在此情况之下几乎不会发生病变，这样的结果只有可能是益生菌抗RV的原因[32]。2010年，RejishKumarV.J完成了一个著名的实验，即冠状病毒TGE在ST细胞中是如何被抑制的。在该实验中，该团队从猪的消化道提取出了植物乳杆菌，将其作用于目标物72小时后仍没有发现病变的痕迹，之后加入同时同源提取出来的唾液乳杆菌上清，发现目标物一直都没有发生病变。该实验可以毫无漏洞地证实乳杆菌对TGE病毒有很强的抑制甚至是杀灭作用[33]。同年，ByeongJooSeo的实验同样能证实Probio-16上清液对病毒有很强的抑制作用，特别是对猪轮状病毒[34]。虽然近年来的研究成果颇丰，但是大多数的研究深度还不够，大多是关于其抗病毒性的作用研究，例如对病毒性感冒、RV腹泻以及HIV等病毒发病的抑制。在Yasui的实验研究中，历史性的发现了益生菌（LactobacillusgasseriPA18，BifidobacteriumlongumSP73，B.bifidumMF25，共三类）抑制呼吸道感染的效果[35]。在他设计的实验中，在小鼠的饲料中添加短双歧杆菌，实验结果发现，短双歧杆菌的生理活动会增加抗流感IgG素的产出，以此达到减少流感发病率。上述提到的Vrese的实验结果显示，益生菌可以极大程度地减少普通感冒的的发病和痊愈时间[36]。经过长期的大量研究表明，患有急性腹泻的儿童用传统的治疗方法效果会很低，在服用乳酸杆菌GG后痊愈时间会减少，而且效果显著，对恢复体力大有好处[38]。乳酸菌属中还有很多种类能够见抑制轮状病毒的活性[39]。可是能够治疗腹泻的乳酸菌种类较少，实验已经证实乳杆菌DN114001对腹泻的防治有很好的效果，但是仅限于轮状病毒。越早添加发酵乳的实验组，益生菌在作用了2～5d后，感染率越低。黄鸿眉的研究中，证实了双歧杆菌对影响IL28、TNF2α分泌的影响，轮状病毒移植到体外的的细胞后，RV病毒可以减少HT29的活性，可以降低IL2β、TNF2α的分泌量，但是在双歧杆菌分泌物的作用后，其抑制作用能明显降低细胞病变速度，双歧杆菌的分泌物对减少受RV感染的机制可能就是这种抑制作用的引起的。4 1.3肠道益生菌抗病毒作用机制研究进展人类对于益生菌的应用和研究将近一个世纪，但是其具体的作用机制还有待研究，也被人们认为是安全的。双歧杆菌属的益生菌对修复消化道的黏膜十分理想，对于保障其屏障作用以及调节作用[40]也有研究显示，双歧杆菌的体外实验中可以减少HT29细胞的寿命，但是有助于增强该细胞的分化以及Markers在作用中的表达。但是倘若该作用的发生场所是体内，则会大大加强消化道上皮细胞对细菌的溶蚀作用，益生菌在干扰病毒的周期方面也是效果明显[41]。其在细胞外的作用效果主要是在抑制病毒吸附上起作用的，由于益生菌及其代谢产物可以加强肠道的黏液分泌，故此达到了对结合受体的屏蔽。实际上，这种方式的肠黏膜屏蔽作用形式单一，但是必须依靠肠达到一定浓度的益生菌才能降低病毒受体的数量。假如益生菌能够附着于肠细胞表面，那么同样也能依靠一系列的抑制作用来减少病毒对消化道内壁的吸附[42]。还有实验证实，干酪乳杆菌DN114001代谢产生的一种复合物是可溶的，其作用效果与拟杆菌属在抑制轮状病毒的作用是一样的。该作用的形成是在改变细胞糖模式，使肠道的上皮细胞得到有效的保护[43]。在轮状病毒所引起的腹泻治疗中，益生菌及其分泌物通过阻止病理的发生，从而减少肠细胞的损耗，达到对机体的保护。益生菌在抑制病毒发生的实验中，有学者认为，双歧杆菌HN019在减少轮状病毒腹泻时的作用机理是通过加强免疫介导来实现的[44]。在降低TNF2α以及IFN2γ时，会对体细胞的通透性造成损伤[45]。通过上述的不同研究，我们可以得出这样的结论：益生菌的不同特异性在其发生有益作用的过程中，作用机理不一样，不同类型的益生菌只对特定的病毒有抑制作用。学者们也给出了另一种解释，益生菌的作用机制在其抗病毒的作用过程中，亦或是与宿主的体细胞在被攻击前就有了相互作用，从而长生类似于抗体一样的专一性物质，在下一次受到此类病毒或者有害细菌入侵时，能迅速地反击，对抗病毒的感染。然而，没有相互作用过的类别则只能缓慢作用，益生菌和肠上皮之间的信息互通，才是引起益生菌的作用机制具有特异性的主要原因。比如引起IFN、IL-21的分泌以及提高其含量[46]。1.4PEDV的概述PED，全称即Porcineepidemicdiarrhea，中文译名：猪流行性腹泻，属于冠状病毒所引起的急性腹泻，各种年龄猪以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高度致死为特征的一种高度接触性肠道传染病[47]。该病于1971年首次在英格兰被发现[48,49]，接着这种疾病就在欧洲大陆肆掠横行[50,51]，在当时也叫做“流行性病毒性腹泻”，英文简称1型EVD。1976年英格兰爆发非TGEV病原引起的所有日龄猪的急性腹泻[52]。为了与之前报道的1型EVD相区别，命名为II型EVD。1977年比利时的Pensaert等人通过电镜从病料中发现与猪传染性胃肠炎病毒无关的冠状病毒样粒子，并将该病毒命名为类冠状病毒CV777株[53]。1982年将Ⅰ型EDV和Ⅱ型EVD统一正式命名为猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV），并沿用至今。1976年我国首次分离了PEDV[54,55]，2010年全国各地爆发了猪流行性腹泻，集中表现在仔猪腹泻、机体脱水死亡，死亡率达到了70%~100%，造成了巨大的经济损失[56,57]。目前PED已经成为了我国最常见的传染病之一[58]。5 1.4.1病原学猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒，在分类上属1群，与有传染性的胃肠炎病毒（TGEV）以及位于其呼吸道的冠状病毒（PRCV）、猫肠炎冠状病毒（FECV）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）和人冠状病毒229E（HCV229E）同属一群[59]。PEDV病毒粒子具有多形性，接近于球形，直径大小为95nm-190nm，由囊膜与核衣売两部分组成，囊膜上有棒状纤突，纤突从核心向四周放射，长度约为18-23nm。PEDV和TGEV在外形上比较像，而且其中央是电子显微镜的不暗域，非常不好区分[60,61]。PEDV基因组全长具有27000-33000个核苷酸，平均28kb，属于单股的正链RNA[62]。其基因组的结构只有两个端点：5ˊ端的帽檐结构；3ˊ端的Poly[63]。其基因组序列属于Kozak，偶尔也存在差异，因为其系列中存在6个ORFs，从5ˊ到3ˊ端的基因很多种类：pplab、S、ORF3蛋白、E型蛋白以及M蛋白。其中多聚蛋白lab基因长度占整个基因组全长的2/3，包括ORFla和ORFlb两个开放阅读框[64]。从大的一端到小的一端顺序如下：5ˊUTR-Replicase-S-ORF3-E-M-N-3ˊUTR，其中ORF1约占据了74%的基因组，位于5ˊ端，由S基因、E基因、M基因、N基因编码病毒的4个结构蛋白及ORF3编码的1个非结构蛋白位于3ˊ端。在PEDV流行性毒株遗传变异和流行情况中，S基因发挥重要作用[65]。1.4.2流行特点PEDV能感染各种年龄的猪。哺乳仔猪、架子猪、育肥猪都极易感染PEDV，尤其是哺乳仔猪，死亡率可高达100%。该病有一定的季节性，多发生在寒冷的秋冬季节，但偶尔也会发生于夏季。发病猪和带毒猪是主要的传染源，污染的环境、工具和饲养员的衣物等亦可散播传染。猪流行性腹泻主要通过消化道传播，但有人报道也可以通过呼吸道传播，猪场一旦感染了PEDV，就会通过直接接触或是间接接触在猪场迅速传播流行。如今PEDV在世界范围内广泛的传播，同时也造成了严重的经济损失。1.4.3致病机制PEDV的致病机制类似于TGEV，PEDV可附在上皮细胞上的一个150kb的受体上，并且比TGE细胞系需要更高密度的猪氨基肽酶受体，在开始发生腹泻之前，上皮细胞已经开始脱落了[66]；6小时后，在回肠会出现双糖酶、碱性和酸性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶和单胺氧化酶水平下降的现象；大日龄的猪中，乳糖酶水平也会下降；在出现症状的24小时后，绒毛会出现弥漫性溶融和萎缩，因此，病毒的增殖造成了细胞功能障碍，致使肠道细胞的吸收面积减少，吸收功能减弱，导致渗透性腹泻1.4.4PEDV的防治如今，流行性腹泻病毒给养猪业造成了严重的经济损失，并且毒株也发生了严重的变异，为6 了有效的防控PEDV的发生，使得越来越多的学者关注PEDV疫苗的研制。目前，临床上应用最多的疫苗为传统疫苗，包括灭活疫苗和弱毒疫苗，并且在PEDV的防治中起到了很重要的作用。随着科学技术的发展，新型疫苗的开发作为近年来研究的主要内容，也取得了一定的成就，包括转基因植物疫苗、重组活载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等等，虽然这些疫苗还未应用于临床实践中，但有广阔的研究前景。1.5研究的目的与意义益生菌是改善消化道功能的主体菌落，在作用过程中也会与其他细菌发生各式各样的作用，使消化道的微生态平衡得到维持，这对保障宿主的健康十分重要。益生菌在其正常的生理活动过程中，会分泌或者代谢出很多物质，这些物质在消化道产生的益生作用原理就是代谢产物抑制有害细菌、并且发生急性排斥作用，从而使宿主的免疫系统得到一定程度的激活，最终达到减少宿主机体的危害。深入的实验研究也证实了：益生菌不但能抑制细菌的活动，减缓病毒对人体的攻击，而且其抗病毒的效果也十分良好。截至目前为止，人们对益生菌的研究大多数是其对人体的作用方面的研究，轮状病毒会导致急性的腹泻，HIV、H1N1等。数据显示，主要针对于动物，特别是人与动物都会被感染的流感病毒、水泡性口炎病等杀伤性比较强的病毒。在临床试验上，必须要加大投入对于研究的支持，争取早日在体外的细胞上也能实现。近年来我国养猪业发展较快，但总体水平不高，主要表现在母猪的出栏生猪数量降低，造成养猪业生产水平低下的主要原因是仔猪死亡率高。据调查，仔猪死亡率占全程死亡率的70%以上，而腹泻引起的死亡数占仔猪死亡数的50%以上，其中引发仔猪高发病率、高死亡率的主要的病原是猪流行腹泻病毒。在前人对于益生菌抗病毒研究基础上，从健康的猪仔粪便中分离具有抗PEDV的活性益生菌，并且对其进行鉴定。实验在体外细胞的环境下进行，并采用MTT比色法，TCID50法以及间接免疫荧光法对初筛猪源益生菌抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的效果进行评估。该实验的目的是验证小猪肠道内益生菌是否存在抗PEDV作用，并且以此衡量其抗病毒能力，给今后的药品开发以理论指导。7 2材料和方法2.1毒株及粪样的来源Vero细胞和PEDVHB/FN毒株：均由本实验室保存。粪样：采自河北省保定市周边养殖场断奶仔猪。2.2主要试剂RPMI-1640、EDTA-胰酶、双抗（青霉素、链霉素）均购自GIBCO公司；PEDV的RT-PCR检测试剂盒：为BeijingAnbealLaboratoriesCoLtd。96孔酶标板：购自Solarbio；快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DNA提取试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；Trizol：宝生物工程（大连）有限公司；氯仿：天津市进丰化工有限公司；异丙醇：天津市进丰化工有限公司；dNTPMixture：宝生物工程（大连）有限公司；DL2000DNAMarker：宝生物工程（大连）有限公司；6×LoadingBuffer：宝生物工程（大连）有限公司；2.3培养基及用液2.3.1细胞培养用液新生牛血清：56℃灭活30min，灭活后分装。PBS（10mmol/L，PH7.4）：NaCl8.00g，KH2PO40.24g，Na2HPO41.44g，KCl0.20g，用三蒸水溶解后定容至1000mL，高温高压除菌15mim后，备用。0.3%胰酶溶液：取0.3g胰酶粉剂，使其溶解在90ml的PBS里，然后定容至100ml，滤器除菌分装后，-20℃保存备用。7.5%NaHCO3：称取7.5gNaHCO3用三蒸水溶解后定容至100ml，高压灭菌15min后备用。1×RPMI-1640不完全营养液：取1袋RPMI-1640粉剂，加入10ml的双抗和2.2gNaHCO3，用三蒸水溶解后定容至1L，过滤除菌，4℃保存备用。1×RPMI-1640完全营养液：1×RPMI-1640不完全营养液90ml，加入10ml的新生牛血清，4℃保存备用（PH=7.2）。8 2.3.2培养基和溶液MRS液体培养基：葡萄糖8g；蛋白胨4g；吐温-0.5ml；酵母提取物2.5g；乙酸钠2.5g；柠檬酸三铵1g；MgSO4·7H2O0.29g；磷酸二氢钾1g；MnSO4·4H2O0.125g；牛肉膏4g；蒸馏水加到500ml，完全溶解后调节pH值5.8～6.2，121℃高压灭菌20min。MRS固体培养基在其基础上添加琼脂粉8g，CaCO₃10g。氯化钙-甘油：60%CaCl2溶液与40%甘油混匀后，高压灭菌后储存于4℃。LB液体培养基：用100mL去离子水溶解1gTryptone、NaCl和0.5gYeastextract，高压灭菌后放置4℃。50×TAE（Tris-乙酸）贮存液：称取Tris碱24.2g、冰乙酸5.71mL和EDTA1.46g，用蒸馏水定容至100mL，室温保存备用。1×TAE电泳缓冲液：用蒸馏水1∶50稀释50×TAE（Tris-乙酸）贮存液室温保存备用。1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100mL1×TAE电泳缓冲溶液中，再加入10mg/mLEB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5µg/mL2.4主要仪器设备仪器名称型号生产厂家高速冷冻离心机Neofuge-15RHealForce超速离心机L8-80M美国BAKEMAN超低温冰箱BCD-205TAHaier公司洁净工作台DL-CJ-2ND1北京东联全自动立式蒸汽灭菌器YXQLS18SI上海博讯医疗生物股份有限公司倒置显微镜BDS2000-PM奥特光学二氧化碳培养箱HERACELL-150iThermoScientificPCR热循环仪T100BIO-RAD公司稳压稳流电泳仪DYY-8C北京六一仪器厂凝胶成像系统GELDOC-2000BIO-RAD公司超微量分光光度计ND-2000CThermoScientific公司冰箱BCD-205TA青岛海尔股份有限公司琼脂糖水平电泳槽DTCZ-24DN北京六一仪器厂电子天平FA-N/JA-N上海民桥精密仪器公司全温振荡培养箱HZQ-F100太仓市豪城实验仪器制造有限公司9 2.5乳酸菌的分离纯化称取1g采集的样品粪便，添加到9ml无菌生理盐水溶解，震荡。将获得的溶液取上清液1ml加入到9ml生理盐水，进行系列倍比稀释，分别取10-7、10-8、10-9的混匀溶液0.1ml加到灭菌MRS固体培养基上，放置于36℃厌氧恒温培养箱培养48h。然后对平皿上的单菌落进行革兰氏染色、镜检并且进行过氧化氢试验。选出革兰氏染色为阳性、过氧化氢试验为阴性的菌落可初步鉴定为所需要的益生菌，将分离的目标菌株进行菌株保存，保存方法：将菌液与灭菌甘油按1:1混合置于-20℃冰箱。2.6PEDV的增殖与检测2.6.1Vero细胞的复苏首先取5ml37℃的1640细胞完全营养液加入到15ml离心管内，然后将本实验室储存在液氮罐内的Vero细胞取出，迅速放入到40℃水内快速解冻，用移液器将细胞液取出加入到15ml离心管内，然后1500rpm离心5min。将离心后的上清液倒掉，加入10ml37℃的1640细胞完全营养液，然后混匀加入到洁净的细胞瓶内，将细胞放入37℃、5%二氧化碳培养箱内，次日换液。2.6.2PEDV的增殖传代选取90%左右单层铺满细胞瓶的Vero细胞，用配好的PBS洗涤两次，然后加入1mL实验室保存的PEDVHB/FN株细胞毒，添加适量胰酶，放入37℃5%二氧化碳培养箱内1h，然后加入9mL1640细胞维持液继续培养，对细胞病变实时观察。2.6.3细胞毒的冻存与收集观察细胞出现到80-90%病变（CPE）时，将细胞放入-80℃冰箱内，然后反复冻融三次，用移液管反复吹打数次，使细胞破裂释放病毒。将细胞毒液移入到15mL的离心管内，2000rpm离心5分钟，收集上清病毒液备用。2.6.4病毒RNA的提取根据TRIZOL试剂说明书，具体操作过程如下：（1）取出500μLPEDV细胞毒放于4℃离心机中，6000rpm离心2min抽取250μL上清并移至新的1.5mL离心管中，加入Trizol750μL，混匀震荡2~3min，室温静置5min。（2）加入200μL氯仿，剧烈震荡1min，室温静置5min，12000rpm离心10min。10 （3）取上清，加入等体积异丙醇，-20℃的环境下静置1~2h。（4）取出离心管，12000rpm离心10min，弃去上清液，尽量吸干管内残留，然后加入600μL75%DEPC水进行洗涤，7500rpm离心5min，弃去上清尽量吸干管内残留。（5）加入RT-PCR洗脱液20μL，溶解核酸，进行反转录。2.6.5病毒cDNA的合成参照PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit说明书进行如下操作：（1）取新的PCR反应管，以上述提取的总RNA为模板，配置20μL反转录体系依次加入以下组分：RNA8.0μLdNTPMixture1.0μLOligodTPrimer1.0μL（2）RT反应程序：65℃水浴5min，冰浴3min。（3）在PCR反应管中依次加入如下组分：RNaseFreedH2O4.5μL5×PrimeScriptBuffer4.0μLPrimeScriptRTase1.0μLRNaseInhibitor0.5μL（4）42℃水浴1h，然后70℃水浴15min。2.6.6病毒基因的扩增以上中获得的反转录产物cDNA为模板，用检测引物上游：5'GCATTTCTACTACCTCGGAACA3'，下游5'GACTTTGGCACAGTCATTTT3'进行常规PCR扩增，在20μLRT-PCR反应体系中依次加入如下成分：模板2.0μL2×EsTaqMasterMix10.0μL上游引物1.0μL下游引物1.0μLRNaseFreedH2O6.0μLTotal20.0μLPCR反应条件：94℃预变性5min94℃变性30s11 50℃退火30s72℃延伸40s35个循环；最后，72℃延伸10min。其扩增产物的目的条带大小为861bp，取5μLPCR反应产物并加入1μL6×LoadingBuffer进行电泳检测（1%琼脂糖凝胶），根据凝胶成像系统观察结果。2.7PEDV毒力的测定将Vero细胞制成细胞悬液，接种到无菌操作的96孔细胞板中，次日将病毒液按照10倍梯度进行连续稀释，从10-1～10-10。稀释好后加入到细胞孔中，每个梯度设立12个重复孔。同样要设立细胞对照组，每天观察细胞的CPE，第五天时，记录出现CPE的细胞孔，按照Reed-Muench两氏法计算TCID50/100μL。2.8抗PEDV乳酸菌的初步筛选将保存的益生菌进行活化，然后进行细菌数量计数，将细菌的数目调整为108CFU/ml。并把每个菌株及其代谢产物和TCID50/100μLPEDV取等量混合一起，然后将混合液在37℃恒温箱中培养,时间为90min，然后3000r/min的速度下离心,时间为10min，取上清加入单层Vero细胞的96孔培养板中，温箱中作用90min，更换维持液，继续培养。每个菌株做三个平行孔，同时样设正常细胞对照组和病毒对照组。应用MTT比色法测定病毒抑制率。2.9乳酸菌的耐酸耐胆盐试验2.9.1耐酸试验将分离的菌株活化三代，调整菌液浓度，大概在108-109CFU/mL范围内。取菌液接在用盐酸酸化到pH值为2.0的液体培养基中，37°C培养90min，培养前、培养后进行平板计数。计算各处理组的菌株存活数，计算出菌株的存活率。2.9.2耐胆盐试验在MRS液体培养基中加入0.3%(w/v)的猪胆盐，选取正常培养基为参照。然后接种已活化的菌种，方法同上，处理4h后计算菌株存活数，并计算存活率。2.10乳酸菌株的初步鉴定2.10.1初筛乳酸菌株的生化鉴定2.10.1.1初筛菌株属的鉴定12 通过过氧化氢试验、明胶液化试验等试验后可鉴定菌株的是否为乳杆菌属。此试验如果都为阴性，可判别为乳杆菌属。2.10.1.2初筛菌株种的鉴定乳酸杆菌属细菌:在前面鉴定的基础上，随即进行糖发酵试验，精氨酸产氨试验;球菌鉴定:进行各类糖发酵试验，精氨酸产氨试验等。按照《常见细菌系统鉴定手册》可判定菌株的属性。2.10.2初筛乳酸菌株16SrDNA鉴定2.10.2.1乳酸菌基因组DNA的提取利用试剂盒提取基因组DNA的提取方法提取益生菌的DNA。2.10.2.2PCR扩增16SrDNA基因序列PCR扩增选用通用引物，引物序列为:，，上游：5-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3；，，下游：5-GTACGGCTACCTTGTTACGA-32.10.2.3进行常规PCR扩增，在25μLRT-PCR反应体系中依次加入如下成分：模板1.0μL2×EsTaqMasterMix10.0μL上游引物1.0μL下游引物1.0μLRNaseFreedH2O12.0μLTotal25.0μLPCR扩增的条件:94℃预变性4min94℃变性30s58℃退火30s72℃延伸2min共35个循环，72℃延伸10min。其扩增产物的目的条带大小为1500bp，取5μLPCR反应产物并加入1μL6×LoadingBuffer进行电泳检测（1%琼脂糖凝胶），根据凝胶成像系统观察结果。2.10.2.416SrDNA基因测序PCR的产物胶回收试剂盒回收后，直接将胶回收产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。2.10.2.5同源性分析与系统发育树的构建利用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），将所测定菌株的16SrDNA序列，与13 GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的16SrDNA/rRNA序列进行比较鉴定，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种。然后从数据库中，找到已知的乳杆菌属标准菌株的16SrRNA/DNA基因序列(表1)，与测定菌株的16SrDNA序列，共同用DNAstar软件以MegAlign进行校准排齐，绘制系统发育树。表1构建发育树乳酸菌参考菌株Table1Constructionofareferencestrainforthedevelopmentoflacticacidbacteria菌种名称菌株号GenBank/EMBL/DDBJ序列注L.aviariusDSM20655M58808L.bifermentansDSM20003M58809L.brevisATCC14869M58810L.delbrueckiiDSM20074M58814L.gasseriDSM20243M58820L.maliDSM20444M58824L.sakeiDSM20017AM113784L.johnsoniiATCC33200AJ002515L.crispatusDSM20584Y17362L.ZeaeATCC15820D86516L.caseiATCC334D865172.11乳酸菌体外抗PEDV作用2.11.1乳酸菌株生长曲线的测定实验前将保存在浓度为20%甘油MRS液体培养基中的初筛益生菌株，使用MRS平板活化三次，菌株活化好后，分别取100μL，接种在MRS液体培养基试管中，然后放到37℃培养箱中厌氧培养。从0h开始，每隔三个小时取出，到达24h后，间隔12h时取出，使用特定的仪器测定其在OD值为590nm下的光密度值，OD数值为纵坐标，时间为横坐标，绘制其生长曲线。2.11.2乳酸菌菌液及代谢产物的制备将菌株进行活化，然后接种在5ml的MRS培养基试管中，菌株的取量为100μL，厌氧条件下培养18h。3000r/min离心10min，吸出上清，生理盐水洗涤三次，然后计数。并把菌体用细胞培养液稀释至需要的浓度，并把上清pH值调整到中性，经0.22μL滤器过滤后备用。2.11.3乳酸菌的细胞毒性测定将不同浓度的菌株及其代谢产物加入96孔细胞培养板中，培养板一定要是已长成单层的14 Vero细胞，置温箱中培养90min。然后倒掉进行洗涤后，加入细胞维持液，继续培养。同时设立病毒对照和正常细胞对照，当病毒对照组细胞达到70%到90%的病变（CPE）时，用MTT法测定OD570值，通过计算细胞的存活率，判定菌株及其代谢产物的最大无毒剂量。2.11.4PEDV多克隆抗体的制备鼠抗PEDV多克隆抗体的制备，具体步骤如下：将PEDV抗原与等量弗氏完全佐剂混合，按每只小鼠50μg抗原的量接种6-8周龄的BALB/C小鼠。第一次免疫后，时间间隔十四天，对小鼠免疫第二次，接种剂量为100μg/鼠。第三次免疫7d后，小鼠尾静脉采血，检测血清中特异性抗体的水平。等达到试验要求时，对小鼠进行眼部采血。然后分离血清，将分离的血清置于极低温度保存备用。2.11.5MTT法间接检测益生菌对病毒的抑制率2.11.5.1实验分组:A组为活菌菌体或菌代谢产物先处理组:从无毒剂量开始，将益生菌或其代谢产物稀释成梯度浓度。先用制备好的不同浓度的菌体或代谢产物预先处理细胞90min，洗涤后，用100TCID50/100μL的PEDV感染细胞。放在培养箱中吸附培养90min后，在用细胞维持液继续培养。B组益生菌或其代谢产物共同处理组:同上浓度为起点，把稀释成的不同浓度的活菌或代谢产物与100TCID50/100μLPEDV等体积混合，然后加入单层Vero细胞中，放在恒温箱中继续培养90min后弃掉培养液，加入维持液继续培养。C组益生菌或其代谢产物后处理组：先用100TCID50/100μLTGEV感染细胞，温箱培养90min后倒掉培养液，加入稀释后的益生菌或代谢产物，置温箱培养90min后洗涤，加入正常细胞维持液，继续培养。D组病毒对照:病毒与培养液等量混合作为病毒对照。E组正常细胞对照。2.11.5.2MTT检测试验观察对照组细菌病变，病变达到80%左右时吸弃各孔培养液，每孔加入20μLMTT(浓度：5mg/mL)和100μL维持液，放入培养箱继续培养4小时。然后后吸去MTT，每孔加入100μLDMSO溶液，振荡10分钟，在570nm处测定OD值。病毒抑制率=（益生菌处理组平均OD值-病毒对照组平均OD值）/（细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值）×100%。2.11.6PEDV毒力受乳酸菌的影响首先测定PEDV的半数组织感染量（TCID50），利用的是Reed-Muench法。将PEDV分别与益生菌作用90分钟后，离心取上清，在Vero细胞平台上用Reed-Muench法计算加入益生菌后的PEDV的半数组织感染量（TCID50），通过前后的变化判断益生菌对PEDV感染细胞的影响。15 2.11.7间接免疫荧光检测PEDV在Vero细胞上受到乳酸菌的影响2.11.7.1先进行细胞处理先将Vero细胞在24孔培养板中培养成单层后加入处理好的益生菌或代谢产物，并设立病毒对照和正常细胞对照。放入培养箱中培养90min。然后用PBS洗涤3次，加入100TCID50的PEDV100μL，继续放入培养箱中培养90min，最后加入维持液，培养2h。2.11.7.2利用间接免疫荧光检测试验中的一抗(鼠抗PEDV多抗)、二抗(HRP标记兔抗鼠IgG)事先准备，一抗工作浓度1：100，二抗工作浓度1:500。处理过的细胞倒掉培养液洗三次，用80%冷丙酮-20固定细胞10分钟，弃去丙酮，PBS再次洗3次，加入工作浓度1：100的兔抗PEDV血清，37℃进行培养2小时，PBS洗3次，加入工作浓度1:500的HRP兔抗鼠IgG37℃作用40min，PBS轻洗3次，立即置显微镜进行观察。16 3结果3.1乳酸菌的分离纯化3.1.1菌落形态将处理后粪样涂布在制备的MRS平板培养基上，培养48h后在平板上面可以观察到有溶钙现象。对分离到的菌株染色镜检，可观察到分离的36株菌都是紫色的革兰氏阳性菌株，菌体形状为杆状和球状两种。镜检结果如下图：革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性球菌图1革兰氏染色镜检结果Fig.1Gramstainmicroscopicresults3.1.2PEDV的增殖与检测结果接种PEDV的Vero细胞，与对照细胞相比，表现为细胞圆缩，胞内颗粒物质增多；随着培养时间的延长，部分细胞逐渐脱落，死亡。当CPE达到70%~80%时，将细胞瓶置于超低温环境中，反复冻融3次后收集细胞病毒液左图：正常细胞右图：病变细胞图2PEDV对Vero的细胞病变效应17 Fig.2CytopathiceffectofPEDVinVerocell3.1.3PEDVRT-PCR鉴定使用PEDVRT-PCR检测试剂盒对PEDV进行鉴定，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，如图3，可见大小为861bp的片段，与预期结果大小相符。M122000bp1000bp861bp750bp100bp图3PEDV的PCR鉴定Fig.3PCRidentificationofPEDVM：DNAMarkerDL20001：毒株2：阴性对照3.1.4PEDV的TCID50测定每天观察细胞的病变情况，在第五天时，对照组细胞生长正常的情况下，出现CPE的细胞孔和对照孔出现了明显的差异，从表2看出，在10-4与10-5之间的稀释度能使50%的细胞出现病变，记录数据，经过Reed-Muench法计算出TCID-4.16/100μL。50=10表2PEDVTCID50测定结果Table2TheTCID50resultofPEDVPEDVCPE孔无CPE孔CPE出现率-110120100%-210120100%-31010283.3%-4107558.3%-5103933.3%-6101118.3%18 3.1.5抗PEDV乳酸菌株筛选结果MTT法筛选的结果如图4、5，分离的36株乳酸菌中有10株对PEDV有明显的抑制作用分别是：B2、B5、B10、B14、B17、B21、B25、B28、B30、B33，不同菌株之间有一定的差异。图4B1-B18MTT初筛结果Fig.4TheresultsMTTforB1-B18图5B19-B36MTT初筛结果Fig.5TheresultsMTTforB19-B36得到有明显抗PEDV活性的菌株，然后通过耐酸耐胆碱试验对其进一步筛选，如图6所示，被检测菌株对低pH值和胆碱有不同的耐受作用，菌株之间存在一定的差异。以成活率20%作为筛选条件，选出需要的菌株作为进一步抗病毒研究。其中符合条件的菌株有B5、B10、B17、B25、B28、B33。19 图6乳酸菌PH2.0和0.3%胆盐处理后存活率Fig.6TheresultofpH2.0and0.3%bileconcentration3.2初筛菌株的鉴定3.2.1生化鉴定结果利用传统的糖发酵实验对初步得到的6株乳酸菌进行试验，试验结果见表3、4、5。通过观察菌株产酸产气的结果，对照《伯杰细菌鉴定手册》，其鉴定出来的结果为：B5、B28、B17、B25四株为植物乳杆菌，B10为粪肠球菌，B33戊糖片球菌。表3B33生化鉴定结果Table3ResultofthebiochemicalidentificationofB33鉴定项目结果过氧化氢酶阴性石蕊牛奶产酸葡糖糖产酸、产气产酸不产气乳糖＋鼠李糖＋核糖＋麦芽糖＋蔗糖＋苦杏仁苷＋葡糖糖酸盐－甘露醇－蜜二糖－甘露糖－注:“+”，“-”分别表示90%以上菌株反应阳性或阴性20 Note:"+","-"meansthatmorethan90%ofthestrainsarepositiveornegative,respectively表4B10生化鉴定结果Table4ResultofthebiochemicalidentificationofB10鉴定项目结果过氧化氢酶阴性石蕊牛奶产酸葡糖糖产酸、产气产酸不产气乳糖－右旋糖＋核糖＋纤维二糖＋蔗糖＋精氨酸＋七叶灵＋甘露醇＋蜜二糖－甘露糖注:“+”，“-”分别表示90%以上菌株反应阳性或阴性Note:"+","-"meansthatmorethan90%ofthestrainsarepositiveornegative,respectively表5B5、B17、B25、B28生化鉴定结果Table5ResultofthebiochemicalidentificationofB5、B17、B25、B28鉴定项目结果过氧化氢酶阴性石蕊牛奶产酸葡糖糖产酸、产气产酸不产气阿拉伯糖＋木糖＋核糖＋葡萄糖＋果糖＋蔗糖＋麦芽糖＋纤维二糖－七叶苷－扁桃苷－木糖＋山梨醇＋注:“+”，“-”分别表示90%以上菌株反应阳性或阴性Note:"+","-"meansthatmorethan90%ofthestrainsarepositiveornegative,respectively21 3.2.216SrDNA鉴定结果将本实验中分离，纯化的乳杆菌利用DNA试剂盒进行DNA提取，将提取的DNA，利用16SrDNA序列引物进行PCR扩增，扩增后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，获得的片段大小和预期1500bp相一致，PCR鉴定结果为图7。M12345672000bp1500bp1000bp100bpM:Marker2000；1：B5；2:B10；3:B17；4:B25；5:B28；6:B33；7:阴性对照图7PCR鉴定结果Fig.7PCRconsequenceofprobiotics3.2.316SrDNA同源性分析及进化树建立图8菌株B5、B17、B25、B2816SrDNA序列同源百分比Fig.816SrDNAhomologyanalysisofB5、B17、B25、B2822 图9根据16SrDNA序列建立的系统发育树Fig.9Phylogenetictreebasedonits16SrDNAsequence将获得的基因片段进行测序，测序结果在NCBI数据库Blast序列对比，结果其同源性可达97%-99%，B5、B17、B25、B28四株为植物乳杆菌，B10为粪肠球菌，B33为戊糖片球菌。其中B5、B17、B25、B28为同一支，所以从中选一株B5作为后续试验备用菌株。3.3乳酸菌体外抗PEDV作用结果3.3.1生长曲线的测定细菌的生长分为四个阶段，对数数期之后到稳定期之前细菌的活力旺盛其间活菌数目也是最多。对菌株在MRS液体培养基中进行培养，测定生长曲线，从而得到细菌最佳的收获时间。从图中可以看出，菌株在三小时后开始以指数状态进行生长，菌株在18h到21h时，较为稳定。因此，可以认为18小时为分离菌株的最佳使用时间。图103株乳酸菌生长曲线23 Fig.10Growthcurveofprobiotics3.3.2乳酸菌对细胞毒性的测定结果由试验结果的计算得出结论，三株益生菌的最大无毒剂量为1011CFU/mL。益生菌的代谢产物最大无毒剂量检测结果是益生菌在108CFU/mL浓度下代谢产物1:2的稀释。因此，在后期试验可以以此为起点对其进行稀释，排除细菌本身对细胞的影响，从而达到试验的准确性。3.3.3MTT法测定结果3.3.3.1乳酸菌接入顺序对PEDV抑制率的结果表中A组表示先接入益生菌，C组表示先接入病毒，B组表示两者同时接入。从得出的数据可以看出无论细胞先接入益生菌，或者先接入病毒，亦或者两者同时接入，都会对病毒在细胞中的增值有一定的影响作用。而且两两之间差异显著，很明显A组和B组病毒抑制率比C组显著增高表6B5接入顺序对PEDV抑制率的比较（平均值±标准差）Table6B5ComparisonofPEDVinhibitionratesbyaccesssequence（⎯X±SD）B5浓度（cfu/ml）A组B组C组10110.402±0.024a0.339±0.005b0.313±0.002c10100.417±0.014a0.371±0.015b0.303±0.001c1090.583±0.011a0.389±0.001b0.277±0.003c1080.572±0.012a0.479±0.004b0.226±0.032c1070.568±0.002a0.414±0.013b0.187±0.017c1060.512±0.032a0.407±0.047b0.154±0.012c1050.347±0.041a0.221±0.007b0.023±0.011c1040.251±0.038a0.087±0.004b0.014±0.001c注：差异极显著用大写字母表示（P＜0.01），差异显著用小写字母表示（P＜0.05）表7B10接入顺序对PEDV抑制率的比较（平均值±标准差）Table7B10ComparisonofPEDVinhibitionratesbyaccesssequence（⎯X±SD）B10浓度（cfu/ml）A组B组C组10110.512±0.143a0.302±0.005b0.301±0.025c10100.572±0.004a0.368±0.007b0.289±0.017c1090.634±0.017a0.404±0.013b0.266±0.041c1080.655±0.033a0.502±0.013b0.276±0.032c1070.508±0.003a0.503±0.013b0.204±0.413c1060.476±0.008a0.456±0.003b0.088±0.016c1050.411±0.019a0.369±0.027b0.012±0.001c24 1040.289±0.012a0.204±0.014b0.007±0.004c注：差异极显著用大写字母表示（P＜0.01），差异显著用小写字母表示（P＜0.05）表8B33接入顺序对PEDV抑制率的比较（平均值±标准差）Table8B33ComparisonofPEDVinhibitionratesbyaccesssequence（⎯X±SD）B33浓度（cfu/ml）A组B组C组10110.334±0.002a0.317±0.031a0.247±0.003b10100.389±0.021a0.388±0.027a0.233±0.016b1090.501±0.029a0.465±0.029a0.207±0.018b1080.525±0.008a0.421±0.014a0.188±0.012c1070.485±0.011a0.389±0.043b0.157±0.008c1060.314±0.013a0.202±0.015b0.123±0.031c1050.307±0.004a0.118±0.014b0.101±0.007b1040.267±0.021a0.081±0.001b0.005±0.001c注：差异极显著用大写字母表示（P＜0.01），差异显著用小写字母表示（P＜0.05）3.3.3.2乳酸菌菌体不同浓度对PEDV抑制率的对比这是三株菌不同的浓度对PEDV抑制作用的结果，从图中可以看出，无论先是菌体先处理还是同时处理，他们都有一个共同的特征就是在浓度在108CFU/ml和107CFU/ml时抑制效果表现为最好。之后随着浓度的降低益生菌对病毒的抑制能力就会下降。25 图11乳酸菌先处理组Fig.11TheresultsofProbioticpretreated图12乳酸菌病毒共同处理组Fig.12TheresultsofProbioticandPEDVatthesametime图13病毒先处理组26 Fig.13TheresultsofPEDVpretreated3.3.3.3乳酸菌代谢产物不同接入顺序对PEDV抑制率对比从表中可以看出代谢产物的接入顺序的不同，组别之间存在一定的差异性。而且受到浓度的影响也很大，B组较A组和C组显著差异高，B组的抑制效果更好一些。表9B5代谢产物不同接入顺序对PEDV抑制率的影响（平均值±标准差）Table9EffectofDifferentAccessSequencesofMetabolitesonPEDVInhibitionRate（⎯X±SD）B5稀释倍数A组B组C组20.484±0.016b0.831±0.076a0.258±0.014c40.441±0.003b0.761±0.061a0.228±0.021c80.376±0.006b0.738±0.048a0.207±0.021c160361±0.016b0.619±0.049a0.199±0.023c320.319±0.011b0.517±0.032a0.125±0.026c640.234±0.028b0.509±0.003a0.055±0.053c注：差异极显著用大写字母表示（P＜0.01），差异显著用小写字母表示（P＜0.05）表10B10代谢产物不同接入顺序对PEDV抑制率的影响（平均值±标准差）Table10EffectofDifferentAccessSequencesofMetabolitesonPEDVInhibitionRate（⎯X±SD）B10稀释倍数A组B组C组20.528±0.032b0.763±0.014a0.311±0.011c40.451±0.001b0.725±0.019a0.243±0.019c80.419±0.012b0.632±0.019a0.245±0.011c160362±0.014b0.553±0.017a0.153±0.009c320.349±0.015b0.438±0.023a0.115±0.026c640.301±0.009b0.367±0.045a0.013±0.001c注：标注大写字母表示差异极显著（P＜0.01），小写字母表示差异显著（P＜0.05）表11B33代谢产物不同接入顺序对PEDV抑制率的影响（平均值±标准差）Table11EffectofDifferentAccessSequencesofMetabolitesonPEDVInhibitionRate（⎯X±SD）B33稀释倍数A组B组C组20.461±0.021b0.739±0.035a0.251±0.004c40.435±0.021b0.721±0.011a0.248±0.007c80.382±0.011b0.568±0.033a0.212±0.012c160.325±0.017b0.533±0.021a0.155±0.039c27 320.271±0.021b0.416±0.039a0.035±0.041c640.233±0.005b0.306±0.007a0.025±0.015c注：标注大写字母表示差异极显著（P＜0.01），小写字母表示差异显著（P＜0.05）3.3.3.4不同浓度代谢产物对PEDV抑制率的对比图14、15、16为三种处理方式下的三株益生菌代谢产物对PEDV抑制率随浓度的变化趋势。从图中可以看出抑制率受到浓度的影响很大，当浓度为两倍稀释时其抑制率最大。随后随着浓度的降低，它们的抑制率也随之降低。图14代谢产物先处理组Fig.14TheresultsofProbioticmetabolitespretreated图15代谢产物病毒同时处理组Fig.15TheresultsofProbioticmetabolitesandPEDVatthesametime28 图16病毒先处理组Fig.16TheresultsofPEDVpretreated3.3.4乳酸菌对PEDV毒力的影响接有PEDV病毒的Vero细胞经过3株益生菌处理后，通过细胞病变测得PEDV的TCID50/100-3.76、10-3.82、10-3.15，与对照组未经过处理组病毒TCID-4.16μL分别为1050/100μL=10作对比，结果可以看出处理后的PEDV的TCID50/100μL均小于处理之前，说明乳酸菌能够降低PEDV的毒力。3.3.5间接免疫荧光结果分析3.3.5.1菌体处理组荧光染色结果图17为菌体处理后的染色结果，试验中的一抗浓度为1:100，二抗的浓度为1:500。A、B、C、D、E分别为正常细胞、病毒对照、植物乳杆菌、粪场球菌、戊糖片球菌。图中的绿色荧光亮点代表病毒感染数量的多少，病毒对照组与其它三个益生菌处理后的荧光结果可以看出，处理后的荧光明显比病毒对照组少。说明这三株益生菌对细胞具有一定的粘附作用，三株菌之间有一定的差异，但是三株益生菌对PEDV都有抑制作用。29 ABCDE图17菌体处理组荧光染色结果Fig.17TheresultofProbioticpretreatedA：正常细胞；B：病毒对照；C：B5；D：B10；E:B333.3.5.2乳酸菌代谢产物处理荧光染色结果图18为三株乳酸菌代谢产物先处理细胞然后接入病毒荧光染色结果。一抗工作浓度为1:100，二抗工作浓度为1:500。A、B、C、D、E分别为正常细胞、病毒对照、植物乳杆菌、粪场球菌、戊糖片球菌。图中的绿色荧光亮点代表病毒感染数量的多少。由染色结果可以看出接入乳酸菌代谢产物的细胞，病毒的感染量明显不如病毒对照组多，从而说明乳酸菌的代谢产物对病毒感染细胞产生了一定的抑制作用，由于菌种的不同所以表现出感染量的不同，抑制作用程度各有差异。ABCDE图18代谢产物预处理荧光染色结果Fig.18TheresultofProbioticmetabolitespretreatedA：正常细胞；B：病毒对照；C：B5；D：B10；E:B3330 4讨论4.1抗PEDV乳酸菌的分离鉴定及初筛过程动物的胃肠道大约五百到一千种微生物生存在其中，胃肠道的细菌随着病原微生物的侵入，能配合免疫细胞进行活动，因而它们也被称为机体防御的“第一道屏障”[67]。益生菌还能联合肠道的其它菌群从而使得肠道内的整个菌群系统产生变化，最终实现肠道的平衡状态。2009年，著名学者黄海等相关研究人员几经试验得出，位于肠道的复合益生菌对病毒具有明显的杀灭作用。现如今益生菌与养猪行业紧密关联，前者已被广范的应用，不过益生菌的作用的稳定性受多种因素影响，譬如一部分的细菌所具有种属之间特异性。郭芳彬于是在1996年经过有关试验得出结论，天然的肠道菌种能较容易的定值于肠道中，因此天然肠道菌种可以作为最理想的添加剂成分[68]。本试验采集到了健康仔猪新鲜粪便作为材料，并且对MRS培养基进行改良，让其pH值较低同时保持乙酸盐离子浓度高到一定程度，在刺激因子吐温-80的有效抑制下，便可以很轻松地从粪便中分离培养出我们所需要的乳酸菌。由于乳酸菌兼性厌氧，所以需要在整个过程中采用5%二氧化碳浓度的环境进行培养。第二个步骤，由于肠道内有胃酸和胆汁，为了确保益生菌能够有效的在肠道环境中产生抑制和防止腹泻，因此选择耐酸耐胆盐是对益生菌进行筛选的一个重要指标。仔猪初生时，它的胃pH值5.0，然后迅速的降为3.0到4.0，三到五天后又降到了2.0到3.0，然后便保持在相对稳定的值[69]。根据Gilliland等人的研究成果，他们均认为能够筛选出耐胆盐的益生菌的最佳浓度是0.3%的浓度[70]。据此，本试验便选取pH值为2.0同时浓度为0.3%的胆盐对猪肠道的生物环境进行模拟，最终筛选出具有抗病毒活性且符合条件的益生菌。一般情况下，筛选益生菌的第一步是分离鉴定，在此基础上继续筛选，挑选出来的菌株都是拥有益生特性的。这种方法的缺点是需要进行大量的工作，所以在本文的研究中，对分离出来的有效菌株使用MTT比色法进行初筛，挑选出来的10株菌株能够抑制PEDV感染Vero细胞。初步筛选的10株乳酸菌进一步做耐酸耐胆碱试验。pH2.0MRS液体培养基和0.3%胆盐MRS培养基是我们模拟肠道环境所必须的。最终筛选出我们为进一步抗病毒试验的乳酸菌。通过实验筛选出来6株具备适应模拟猪胃肠环境的特异性的乳酸菌。然后分别鉴定出6株乳酸菌的种属，将其作为接下来实验的备用菌株。为了提高的实验结果的可靠性和准确性。对分离的乳酸菌采用生理生化和16SrDNA双重鉴定。通过鉴定，最终筛选出的6株乳酸菌分别是4株植物乳杆菌，粪场球菌和戊糖片球菌各1株。4.2乳酸菌体外抗PEDV作用分析首次益生菌具有抗病毒作用的结论是学者对导致仔腹泻轮状病毒的研究中发现的。大量研究表明鼠李糖乳酸杆菌(LGG)对RV感染有特异性保护作用，主要作用表现为，能够有效的降低RV腹泻的发病周期，使腹泻的次数明显变少，抑制轮状病毒的外排数量，维护肠道的通透性，同时刺激机体产生能有抵抗轮状病毒的特异性抗体[71]。31 伴随着科学家对益生菌的不断了解，对其抗病毒机制的相关研究也更系统更深化，抗病毒的菌株的发现以及为今后临床的应用做出巨大的贡献[72]。目前益生菌的抗HIV、流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)等多种病毒的研究得到了证实。在抗病毒领域内，益生菌因其独特的抗病毒特性，已经显示出了十分光明的前景。在现代世界养猪行业的发展中，最常见的问题是猪腹泻，仔猪感染这一疾病的临床表现是呕吐，急性腹泻，最终引起脱水，对于出生不足2周的仔猪来说，一旦感染，致死率特别高，导致大量幼猪死亡，对于养猪业来说，损失是十分巨大的。因此，迫切的需要开发出兼具安全性和可靠性得治疗措施，经过几年的研究，益生菌在体外试管平台上的抗病毒作用得以实现。本试验主要使用MTT，间接免疫荧光等方法进行试验，通过试验挑选出具有抗PEDV活性的益生菌。根据实验结果进行初步分析益生菌抗PEDV的机制，为益生菌在未来抗病毒的应用上提供一些理论依据。4.2.1MTT法检测抗PEDV作用的分析1983年，Mosmann在对细胞的生存和繁殖方法进行研究的过程中，总结出了MTT法[73]。这一方法的实验原理是：外源性MTT（其成分四甲基偶氮哇盐）将活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色结晶甲攒(Forrnazan)，并且这一物质能够在细胞中沉积。已经死亡的细胞中这种酶也不再具有活性，因而无法进行MTT还原。这一反应得到的甲攒用二甲基亚砜(DMSO)与水发生溶解后，在560-610nm的条件下进行观察，发现这一物质的光吸收值与细胞活性之间呈现正相关。早在1988年，Pauwels等人就利用MTT法的抗病毒特性研究抗HIV功效[73]。在这以后MTT法还在HSV,NDV,HCMV(人巨细胞病毒)等不同种类病毒的研究实验中被应用。现阶段，在研究利用中草药的特殊功效进行体外抗病毒治疗的过程中，主要实验方法就是MTT法。卢长安等人经过多次的实验，在不断得探索和完善之后，得到了可以使用体外药物抗HIV研究的MTT试验方法[74]。邵文爱等人在研究阿昔洛韦(ACV)的时候也使用了MTT法，具体研究其抵御细胞毒性的原理以及其抗单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的机制[74]。刘群等人在研究中药复方体外抗新城疫病毒的时候，也选择了MTT法进行评价[76]。王占峰等人通过血凝实验研究益生菌体外抗病毒的情况和特点，之后使用MTT法进行评论，最终证实益生菌确实对NDV具有一定得抑制[77]。进行这一试验的第一步是对挑选出来用于实验的38株乳酸菌进行筛选，了解其抗病毒的特性，这一过程是通过MTT法进行评价的。在这以后，按照乳酸菌及其代谢产物各自的接入顺序和浓度，继续深入研究益生菌与PEDV感染细胞之间的关系。这一试验过程，也选择了MTT评价方法。4.2.1.1乳酸菌不同作用方式抗PEDV作用的分析为了研究益生菌抗PEDV效应，本次实验运用了三种不同作用方式来分析，实验的结果简述了益生菌可能存在的几种抗病毒方式。益生菌菌株或代谢产物与细胞结合，经过一系列生物学效应之后，第二次感染病毒使机体对PEDV的抑制率有明显的提高，据猜测其主要原因是益生菌或者其代谢物中的某种成分能够阻止病毒表面的结合位点与病毒受体附近的分子相结合，由于造成32 了位置阻塞的问题，使细胞不能粘附病毒。从TakaoM实验中了解到，益生菌发挥生理效应的首要条件是粘附，粘附素是益生菌与受体细胞结合的媒介，阻断了病毒的结合位点，有效的发挥了其生物学的竞争性保护作用[78]。Bernet等科学家从人体肠道的Caco-2细胞上的粘附的物质中找到了乳酸杆菌，从而了解到病毒的粘附作用和病毒侵入细胞的抑制机制[79]。与此同时，SHERMAN等科学家也在引起肠道疾病最主要的细菌大肠埃希菌中发现了，粘附在T-84单层上皮细胞上的某些细菌，如嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，对大肠埃希菌的粘附起到了阻碍的作用，有缓解疾病的治疗作用[80]。Silva等科学家在含有乳酸杆菌的营养液中，观察到抑制病毒感染人体肠道引起疾病的类似细胞Caco-2，反应出较高的抑制结合位点的活性的作用[81]。抑制病毒的对细胞的感染，可以采用益生菌/代谢产物与病毒同时接入细胞的方法，从而减少病毒的活性，同时抑制Vero细胞内病毒的活性表达。又或许是因为病毒遭到了益生菌及其代谢物对其DNA和Pr结构整体的破坏；还可能是因为已经感染细胞中病毒繁殖能力降低使病毒的吸附能力也降低;最后还可能是抑制DNA形成的某些物质存在于菌株或其代谢物中，从而达到了抑制病毒的转录与合成，还有复制。使病毒无法形成完整的，具有复制能力的病毒颗粒。TAO还表明指出乳酸菌可以干扰HIV的复制繁殖，他是通过特异性的结合HIV表面的粘附糖蛋白gp120中的富含甘露糖区域而实现的[82]。但是，利用这种方法保护肠道的健康和菌群平衡是很困难的，因为其作用机理与菌体的浓度和细菌表面病毒的结合的密度息息相关。粘附细胞通过益生菌与肠道上皮细胞相互接触，发挥作用。在粘附过程中的乳酸菌的作用力有:被动作用力、静电力、疏水力、空间作用力、磷脂酸和一些特殊的结构之间的作用力[83]。一些起到粘附作用的因子也能在细胞表面发挥很大的作用。例如：一种粘附促进因子分子量为29kDa，他可以允许使益生菌粘附在于猪肠道上皮细胞的粘膜层上[84]。另外，细胞接受病毒的感染后，再让其在含有益生菌或者其代谢产物的物质培养，发现抑制作用不如前两者明显，但是也在一定程度上对PEDV起到了抑制作用。这种情况，也许是因为病毒的RNA的复制和病毒颗粒的装配发生了抑制作用，这是由益生菌所产生的小分子肽类活性物质可以进入胞浆而引起的。还有一种原因是细菌的抗病毒反应，他是在菌株接入后产生的反应，他破坏了细胞间的信息传递，极大程度上改变了细胞的形态。现在已经有实验证明乳酸菌GG可以促进人类的肠道黏膜细胞的生长，其作用机制是通过乳酸菌的两种多肤类活化Akt调节信息传递的方式来防止细胞因子损伤[85]。经实验数据得出，益生菌本身及其它相关物质在各种不尽相同的作用下对PEDV有着不同的阻碍作用。其中产生最强阻碍效果的实验小组就是益生菌预处理组，但未预料到的是能对PEDV产生较强抑制作用的一组则是其代谢产物与病毒同时接入组。这或许是因为它取决于不同原理的抗病毒能力。要完善其抗病毒能力的首要因素是要引用占位能力以及捕获病毒的能力和完善细胞的调节能力。由于益生菌在其生长代谢过程中生产许多具有抗病毒活性的化合物，如细菌素、维生素、多糖、小分子类及酸性代谢产物等，他们的作用包括，可以拮抗、阻止病原体的繁殖;可以相应细胞的免疫功能;可以被相应细胞简单的利用，可以促进肠道对营养物质的消化吸收。33 4.2.1.2乳酸菌不同浓度抗PEDV作用分析益生菌和它的代谢产物要想具有抗病毒功能的性质对于浓度具有一定的要求。即，只有在浓度达到一定的数值时，这种抗病毒效应才会充分的发挥其作用。Tanja等致力于益生菌和水泡性口炎病毒的研究。她证实了益生菌的抗病毒性与其浓度有关，浓度为105CFU/mL时是分界线，当高于这个数值时抗病毒功效才会产生[86]。本实验中，我们主要研究益生菌在Vero上对PEDV抑制率的影响，选取的变量是益生菌的浓度。在实验过程中，我选选取了3中作用方式。结果发现，效量关系在益生菌及它的代谢物对PEDV作用时具有明显的体现。显然不同浓度的乳酸菌，抗病毒活性均不一。只要达到一定的浓度才会表现出较好的抑制效果。菌体浓度为108CFU/mL时效果比较好，而代谢产物在两倍稀释时有较好的抑制效果。4.2.2TCID50检测乳酸菌对PEDV毒力影响的分析我们把50%组织细胞感染量也可以称为TCID50半数组织培养感染剂量。对病毒滴度的检测方法有很多，然而最常用的则是观测半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(CPE)的病毒量。在本次实验中，主要以TCID50来检测益生菌与PEDV之间的关系。最终我们发现，当PEDV接触过益生菌后病变明显降低，因此得出了益生菌具有抗病毒性这一结论。4.2.3间接免疫荧光法检测乳酸菌抗PEDV作用的分析免疫荧光技术的目前正在高速发展。学者们在前人的基础上研制出了一种非常易懂的检测方法，即间接免疫荧光技术。这项技术目前在实验中也被广泛应用，它的实验具有较为复杂的步骤。其中，对于抗原固定和一抗以及二抗浓度的检测，是相当关键的一步。抗原抗体特异性结合的成功率受抗原固定质量的影响；然而，非特异性荧光能够出现则是受到了一、二抗的浓度的影响。如今，这样手段在细菌与病毒检测的实验中是一种常见方法。黄愈玲等（2010）在研究沙门氏菌的敏感性的课题时，便应用到了上述方法，并得出了该实验对于食品安全的快速检测具有很好效果的结论[87]。司炳银等（2003年）成功的通过采用间接荧光技术对SARS冠状病毒抗体进行了染色，具有非常完美的功效。后来，将这项研究成果应用到了临床，对154位患SARS的病人进行了血清检测后也更加证实了司炳银等的实验结论，它也成为SARS实验室中一项经典研究手段。对携带PRRSV的猪肺组织，将其做成触片后，也同样采用了间接免疫荧光法进行实验，最终也是同样的对该组织中携带的特定病毒进行了成功检验[88]。张超等用这种方法对不同类别EVB同MS之间的相关联系展开了探究，最终发现MS发病一定程度上与EBV是有一定关系的。间接免疫荧光技术还被应用于体外抗病毒的研究。肖传飞等把MTT作为一种辅助原料，探究了该方法能否应用在CAPS体外抗NDV感染鸡胚成CEF作用，最终发现该手段对于细胞中病毒的繁殖能够产生十分直接的观察，也为中药抗病毒研究提出了新的思路[89]。本实验根据MTT法，选择出工作浓度预处理细胞，即能够最大限度抑制PEDV的益生菌及其代谢产物的浓度。随后，把100TCID50的PEDV增添到其中。实验结果表明，益生菌及其代谢34 物抗PEDV效果相当明显，且能够有力的证实其抗PEDV的功能。MTT检测后的现象与该实验结果是一样的，我们认为存在两种可能。第一种可能是，益生菌因空间位阻效应使得其预处理细胞时，PEDV被该过程中产生的粘附占位效应抑制，病毒也因此失去了快速侵占细胞的机会，益生菌抗PEDV的能力大大增强；第二种可能是一种病理过程，即，益生菌对细胞的调解功能起到了积极影响，让获得性免疫及限制炎症收到了“指令”，对病毒起到一定的抑制作用。这个实验的最终结论同肖传飞等的是一模一样的。通过以上能够得到，该实验将分离出来的36株乳酸菌中选取了3株。经过分析得出，这3株菌株具有一定的抑制病毒的作用。此次试验中可知，不仅仅是菌株本身对PEDV具备抑制效果，而且其代谢后的物质同样对其有着抑制效果，然而两者的干扰方式各异。本次实验过程中仅对流行性腹泻病毒进行了研究，其对病毒的抑制作用是否为普遍性，能否对别的病毒同样起到抑制作用，仍需深入分析。由于益生菌较易获得，造价低廉，效果显著等多种特点，因此益生菌抗毒越来越受到关注。有相关资料显示，益生菌的各种生存形态以及其代谢物质均有对病毒的抑制作用，但是抗病毒的效果不一，其干扰病毒的方式也各异。在本次实验的研究对象为益生菌类以及其代谢物质，分别用不同工作模式，通过不同的实验模式，对菌体以及其代谢物质进行实验，用以分析其对病毒的抑制效果。根据结果可知，与泰国WandeeSirichokchatchawan学者得到的实验结果一样。本次实验主要对抑制PFDV活性的益生菌进行了研究，分析了益生菌进行抑制PED的机理，为继续增大益生菌抗病毒谱起到了促进作用。35 5结论6.1从健康仔猪粪便中分离得到36株具有乳酸菌特性的菌株，其中初步得到抗病毒作用的菌株有10株，而4株不能耐酸耐胆碱被淘汰。从中选取3株菌一株植物乳杆菌、一株为粪肠球菌、一株为戊糖片球菌进行抗病毒试验。6.2利用三株乳酸菌活的菌体及其代谢产物在体外细胞模型上，利用MTT比色法，TCID50法和间接免疫荧光法对其抗PEDV效果进行评估，得出三株菌对PEDV在Vero细胞上的增殖有不同效果的抑制作用，其中不同的浓度也有一定的抑制效果。36 参考文献[1]LILLYDMProbioticsGrowthPromotingFactorsProducedbyMicroorganisms[J].Science1965,147:747-748.[2]FΜLLERR.ProbioticsinManandAnimals[J].ApplBacterio,1989,66:365-378.[3]ByeongjooS,MiranM,KumarVJR,etal.BiletolerantLactobacillusreuteriisolatedfrompigfecesinhibitsentericbacterialpathogensandporcinerotavirus.[J].VeterinaryResearchCommunications,2010,34(4):323.[4]IvecM,BotićT,KorenS,etal.Interactionsofmacrophageswithprobioticbacterialeadtoincreasedantiviralresponseagainstvesicularstomatitisvirus[J].AntiviralResearch,2007,75(3):266-274.[5]MartínV,MaldonadoA,FernándezL,etal.Inhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1bylacticacidbacteriafromhumanbreastmilk.[J].BreastfeedingMedicine,2010,5(4):153-158.[6]SaavedraJM.[Probiotics,immunityandpediatrichealth][J].GacetaMedicaDeMexico,2011,147Suppl1(147Suppl1):9-21.[7]ShahNP.Functionalculturesandhealthbenefits[J].InternationalDairyJournal,2007,17(11):1262-1277.[8]马治宇.乳酸菌及其培养液对肉鸡生产性能、肠道菌群及肠道结构的影响[D].西北农林科技大学硕士学位论文，2008.[9]李琐.益生菌雏鸡对鸡ND免疫后免疫器官功能及IL-2+mRNA表达变化[D].东北农业大学硕士学位论文，2010.[10]邝哲师,田兴山,张玲华,等.芽孢杆菌制剂对断奶仔猪体内消化酶活性的影响[J].中国畜牧兽医,2005,32(6):17-18.[11]霍军，程会昌，宋予震.抗生素与芽抱杆菌制剂对猪生产性能影响的比较研究闭.现代畜牧兽医，2004,11:19-20.[12]ChenW,LiuF,LingZ,etal.HumanIntestinalLumenandMucosa-AssociatedMicrobiotainPatientswithColorectalCancer[J].PlosOne,2012,7(6):e39743.[13]BianG,MaL,SuY,etal.Themicrobialcommunityinthefecesofthewhiterhinoceros(Ceratotheriumsimum)asdeterminedbybarcodedpyrosequencinganalysis[J].PlosOne,2013,8(7):e70103.[14]WhiteAG,WattsGS,LuZ,etal.EnvironmentalArsenicExposureandMicrobiotainInducedSputum[J].InternationalJournalofEnvironmentalResearch&PublicHealth,2014,11(2):2299-2313.[15]ThoetkiattikulH,MhuantongW,LaothanachareonT,etal.Comparativeanalysisofmicrobialprofilesincowrumenfedwithdifferentdietaryfiberbytagged16SrRNAgenepyrosequencing[J].CurrentMicrobiology,2013,67(2):130.37 [16]MaldonadoGC.StimulationofInnateImmuneCellsInducedbyProbiotics:ParticipationofToll-LikeReceptors[J].2015,06(1).[17]GandhiA,ShahNP.SaltReductioninaModelHigh-SaltAkawiCheese:EffectsonBacterialActivity,pH,Moisture,PotentialBioactivePeptides,AminoAcids,andGrowthofHumanColonCells[J].JournalofFoodScience,2016,81(4):H991-H1000.[18]KandelDR,HartshornKL.ProphylaxisandTreatmentofInfluenzaVirusInfection[J].NewEnglandJournalofMedicine,1990,322(7):443-50.[19]YASUIH,KIYOSHIMAJ,HORIT,etal.ProtectionagainstinfluenzavirusinfectionofmicefedBifidobacteriumbreveYIT4064[J].ClinicalandDiagnosticLaboratoryImmunology,1999,6(2):186-192.[20]VRESEDEM,WINKLERP,RAUTENBERGP,etal.Probioticbacteriareduceddurationandseveritybutnottheincidenceofcommoncoldepisodesinadoubleblind,randomized,controlledtrial[J].Vaccine,2006,24:6670-6674.[21]Guérin-DananC,MeslinJC,ChambardA,etal.FoodsupplementationwithmilkfermentedbyLactobacilluscaseiDN-114001protectssucklingratsfromrotavirus-associateddiarrhea[J].JournalofNutrition,2001,131(1):111-117.[22]TAO.2004.http://hivworkshop.com/may04-3-1.Htm.[23]RAOS,HUS,MCHΜGHL,etal.TowardalivemicrobialmicrobicideforHIV:commensalbacteriasecretinganHIVfusioninhibitorpeptide[J].ProcNatlAcadSciUSA,2005,102(34):11993一11998.[24]TANNOCKGW,MUNROK,HARMSENHJM,etal.AnalysisofthefecalmicrofloraofhumansubjectsconsumingaprobioticproductcontainingLactobacillusrhamnosusDR20fJ].App1EnvironMicrobiol,2000,66(6):2578-2588.[25]DRAGOL,GISMONDOM.R,LOMBARDIA,etal.InhibitionofinvitrogrowthofenteropathogensbynewLactobacillusisolatesofhumanintestinalorigin[J].FEMSMicrobiologyLetters,1997,153,455-463.[26]OUWEHANDA.C.ISOLAURIE.SALMINENS.Theroleoftheintestinalmicrofloraforthedevelopmentoftheimmunesysteminearlychildhood[J].EuropeanJournalofNutrition,2004,(41):132-137.[27]VANNIELC.W,FEUDTNERC,GARRISONM.M,etal.Lactobacillustherapyforacuteinfectiousdiarrheainchildren:Ameta-analysis[J].Pediatrics,2002,109,678-684.[28]ZHANGW,AZEVEDOM.S.P,WENK,etal.ProbioticLactobacillusacidophilusenhancestheimmunogenicityofanoralrotavirusvaccineingnotobioticpigs[J].Vaccine,2008,26,3655-611.[29]KRITASS.K,MORRISONR.B.EffectoforallyadministeredLactobacilluscaseionporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusvaccinationinpigs[J].VeterinaryMicrobiology,2007,119:248-255.38 [30]GIANGH.H,VIETT.Q,OGLEB,etal.Growthperformance,digestibility,gutenvironmentandhealthstatusinweanedpigletsfedadietsupplementedwithpotentiallyprobioticcomplexesoflacticacidbacteria[J].LivestockScience,2010,129,95-103.[31]TANJABOTIC.Anoveleukaryoticcellculturemodeltostudyantiviralactivityofpotentialprobioticbacteria[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2007,227-234.[32]黄鸿眉，程茜.双歧杆菌对轮状病毒感染肠上皮细胞IL-8和TNF-a分泌的影响[[J].第四军医大学学报，2007,28(22):2054-2056.[33]REJISHKΜMARV.J.PutativeprobioticLactobacillussppfromporcinegastrointestinaltractinhibittransmissiblegastroenteritiscoronavirusandentericbacterialpathogens[J].TropAnimHealthProd,2010,42:1855-1860.[34]BYEONGJOOSEO.BiletolerantLactobacillusreuteriisolatedfrompigfecesinhibitsentericbacterialpathogensandporcinerotavirus[J].VetResCommun,2010,34:323-333.[35]TurnbaughPJ,HamadyM,YatsunenkoT,etal.Acoregutmicrobiomeinobeseandleantwins.[J].Nature,2009,457(7228):480.[36]VeresR.[Theoralapplicationofberotecinthetherapyofobstructiveairwaydiseases][J].FortschrMed,1978,96(10):553-7.[37]FujiiK,SuyamaM,ChibaK,etal.Acutedisseminatedencephalomyelitisfollowing2009H1N1influenzavaccine[J].PediatricsInternational,2012,54(4):539-541.[38]WolcottRD,SteinerJM,EliasW,etal.Theeffectofthemacrolideantibiotictylosinonmicrobialdiversityinthecaninesmallintestineasdemonstratedbymassiveparallel16SrRNAgenesequencing[J].BmcMicrobiology,2009,9(1):1-16.[39]SuchodolskiJS,DowdSE,WilkeV,etal.16SrRNAGenePyrosequencingRevealsBacterialDysbiosisintheDuodenumofDogswithIdiopathicInflammatoryBowelDisease[J].PlosOne,2012,7(6):e39333.[40]XiaoM,WangY,ZhuZ,etal.InfluenceofNS5Aproteinofclassicalswinefevervirus(CSFV)onCSFVinternalribosomeentrysite-dependenttranslation.[J].JournalofGeneralVirology,2009,90(12):2923-2928.[41]VaziriND,WongJ,PahlM,etal.Chronickidneydiseasealtersintestinalmicrobialflora[J].KidneyInternational,2013,83(2):308-315.[42]ZhouAL,HergertN,RompatoG,etal.WholegrainoatsimproveinsulinsensitivityandplasmacholesterolprofileandmodifygutmicrobiotacompositioninC57BL/6Jmice.[J].JournalofNutrition,2015,145(2):222-230.[43]CandonS,PerezarroyoA,MarquetC,etal.Antibioticsinearlylifealterthegutmicrobiomeandincreasediseaseincidenceinaspontaneousmousemodelofautoimmuneinsulin-dependentdiabetes.[J].PlosOne,2015,10(1):e0147888.[44]SaxenaD,LiY,DevotaA,etal.ModulationoftheorodigestivetractmicrobiomeinHIV-infectedpatients[J].OralDiseases,2016,22(S1):73-78.39 [45]NadkarniMA,SimonianMR,HartyDWS,etal.Lactobacilliareprominentintheinitialstagesofpolymicrobialinfectionofdentalpulp.[J].JournalofClinicalMicrobiology,2010,48(5):1732-1740.[46]LanPT,SakamotoM,BennoY.EffectsoftwoprobioticLactobacillusstrainsonjejunalandcecalmicrobiotaofbroilerchickenunderacuteheatstressconditionasrevealedbymolecularanalysisof16SrRNAgenes.[J].Microbiology&Immunology,2004,48(12):917-929.[47]SergeevOV.Porcineepidemicdiarrhea.VoprVirusol，2009，54(2)：4-8.[48]PensaertMB，BouckP.Anewcoronavirus-likeparticalassociatedwithdiarrheainswine[J].ArchivesofVirology，1978，58(3)：243-247．[49]ChaseyD，CartwrightSF.Virus-likeparticlesassociatedwithporcineepidemicdiarrhoea[J].Researchinveterinaryscience，1978，25(2)：255-256.[50]DebouckP，PensaertM.ExperimentalinfectionofpigswithaporcineentericcoronavirusCV777[J].AmJVetRes,1980,41(2):219-223.[51]李佑民，柳桂信，朱维正，等.吉林省“猪传染性胃肠炎”疫情调查、人工感染传代和病毒分离试验[J].家畜传染病，1981，(1):1-7．[52]李思银，杨亮宇，杨玉艾.猪流行性腹泻的实验室诊断方法[J].猪业科学，2010，27：54-57.[53]李晓东.猪流行性腹泻研究进展[J].河北畜牧兽医，2005，21：29-30.[54]徐国栋，李峰，张广峰.国内猪流行性腹泻防治概况[J].畜牧与兽医.2011，43（12）：88-89.[55]刘涛,王瑞.猪流行性腹泻的实验室诊断方法研究进展[J].猪业科学,2010(12)：60-61.[56]林裕胜，王隆柏，吴秋玉，等.福建省猪流行性腹泻流行病学调查[J].中国农学通报，2014，30(35):83-86.[57]张海明，田野，王艳丽，等.猪流行性腹泻病毒流行病学调查综述[J].猪病科学，2013，(3):90-91.[58]StrawBE，ZimmermanJJ，AllaireSD，等.猪病学[M].9版.北京:中国农业大学出版社，2008:399-406．[59]GonzálezJM,GomezpuertasP,CavanaghD,etal.AcomparativesequenceanalysistorevisethecurrenttaxonomyofthefamilyCoronaviridae.[J].ArchivesofVirology,2003,148(11):2207-2235.[60]殷震,刘景华.动物病毒学[M].第—版,北京:科学山版社,1997,688-690.[61]HofmannM,WylerR.Quantitation,biologicalandphysicochemicalpropertiesofcellculture-adaptedporcineepidemicdiarrheacoronavirus(PEDV)[J].VeterinaryMicrobiology,1989,20(2):131-42.[62]KocherhansR,BridgenA,AckermannM,etal.Completionoftheporcineepidemicdiarrhoeacoronavirus(PEDV)genomesequence.[J].VirusGenes,2001,23(2):137-144.[63]SethnaPB,BrianDA.Coronavirusgenomicandsubgenomicminus-strandRNAscopartitioninmembrane-protectedreplicationcomplexes[J].Journalofvirology,1997,71(10):7744-7749.[64]王凤,汤德元,李春燕,等.猪流行性腹泻病毒基因及其疫苗的研究[J].猪业科学2010;27:42-47[65]ParkSJ,MoonHJ,YangJS,etal.SequenceanalysisofthepartialspikeglycoproteingeneofporcineepidemicdiarrheavirusesisolatedinKorea[J].VirusGenes,2007,35(2):321.40 [66]刘邓，袁秀芳，冉多良，等.TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用[J].中国动物传染病学报，2010,18(1):28-33.[67]ECKMANN,L.，KAGNOFF,M.F.，FIERER.Intestinalepithelialcellsaswatchdogsforthenaturalimmunesystem[J].TrendsMicrobiol,1995,3:118-120.[68]郭芳彬.可直接饲用微生物在畜牧业上的应用（一）[J].饲料研究，1996,(1):13-14.[69]张名涛，顾宪红，杨琳.猪消化道微生态及其调控研究进展[J].兽药与饲料添加剂，2003,8(2):30-33.[70]S.E.GILLILAND,T.E.STALEY,L.J.BUSH.ImportanceofBileToleranceofLactobacillusacidophilusUsedasaDietaryAdjunct[J].JournalofDairyScience,1984,67(12):3054-3051.[71]GUANDALINIS.Probioticsforchildrenwithdiarrhea:anupdate[J].ClinGastroenterol,2008,42(2):53-57.[72]王占峰，鸡胚肠组织细胞培养及益生菌抗NDV作用研究[D].东北农业大学硕士学位论文，2010.[73]PAUWELSR.Rapidandautomatedtetrazolium-basedcolorimetricassayforthedetectionofanti-HIVcompounds[J].ViroIMethods,1988,20:309-321.[74]卢长安，王满霞，孙刚.MTT法在抗HIV药物研究中的应用[J].中国中医基础医学杂志，1999,4(9):23-25.[75]邵文爱，张丽媛，李康生.抗病毒药物筛选中两种方法的比较[J].汕头大学医学院学报，2006,19(1):52-54.[76]刘群，段亮亮，江平康.中药复方抗鸡新城疫病毒作用研究[J].安徽农业科学.2010.38(20):10697-10699.[77]赵满仓，魏文青，刘晶等.MTT法抗肿瘤药敏试验影响因素的探讨[J].临床肿瘤学杂志，2009,14(4):73-81.[78]TAKAOM,TOMOKOA,ERIS,etal.InhibitionofbindingofHelicobacterpyloritotheglycolipidreceptorsbyprobioticLactobacillusreuteri[J].FEMSImmuMedMicrobiol,2002,32:105.[79]M.BERNET,F.D.BRASSART,J.R.NEESER.LactobacillusacidophilusLA1bindstoculturedhumanintestinalcelllinesandinhibitscell-attachmentandcell-invasionbyenterovirulentbacteria[J].Gut,1994,35:483-489.[80]IBNOU-ZEKRIN,BLΜMS,SCHIFFRINEJ,etal.DivergentpatternsofcolonizationandimmuneresponseelicitedfromtwointestinalLactobacillusstrainsthatdisplaysimilarpropertiesinvitro[J).InfectImmun,2003,71(1):428-436.[81]M.SILVA,N.VJACOBUS,C.DENEKE,etal.AntimicrobialsubstancefromahumanLactobacillusstrain[J].Antimicrob.AgentsChemother,1987,31:31-33.[82]TAO.2004.http://hivworkshop.com/may04-3-1.Htm.[83]许坷.益生菌对致病E.coli粘附鸡肠纹状缘膜的抑制作用[D].东北农业大学农学硕士学位论文.2009.41 [84]L.BLOMBERGA.HENRIKSSON,P.L.Conway.InhibitionofadhesionofEscherichiacoliK88topigletdealmucusbyLactobacillusspp[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2008,59:34-39.[85]YANF,CAOH,COVERTL,etal.Solubleproteinsproducedbyprobioticbacteriaregulateintestinalepithelialcellsurvivalandgrowth[J].Gastroenterology,2007,132:562-575.[86]TANJABOTIC’,TRINEDAN’KLINGBERGHANAWEINGARTL,etal.Anoveleukaryoticcellculturemodeltostudyantiviralactivityofpotentialprobioticbacteria[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2007,115:227-234.[87]黄愈玲，李少彤，龚玉娇.间接免疫荧光检测技术检测沙门菌的实验研究[J].热带医学杂志，2010,10(8):935-941.[88]彭长凌，高裕，刘秀梵.PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用[J].中国兽医科技，2005,35(4):256-260.[89]肖传飞，葛铭，张瑞莉.间接免疫荧光技术研究黄茂多糖体外抗新城疫病毒作用[J].中国兽医杂志，2011,47(7):65-67.42 作者简介姓名：郑常龙性别：男出生日期：1992年07月24日籍贯：河北省保定市学习经历：2011年9月-2014年6月，就读于河北农业大学动物医学院畜牧兽医专业。2014年9月-2016年6月，就读于河北农业大学动物医学院动物医学专业。2016年9月-2018年6月，就读于河北农业大学研究生学院兽医专业。最后学历（学位）：兽医硕士毕业院校：河北农业大学获奖情况：2016-2017学年：获得校级二等奖学金43 致谢时光飞逝，我的研究生学习生涯即将结束。本论文是在我的导师左玉柱副教授的悉心指导下完成的，从课题的选择、试验的设计和成功开展以及论文的撰写。感谢左玉柱副教授始终给予我耐心的指导及支持。左老师严谨的科研态度、勇于创新的科研精神、精益求精的工作作风，深深地感染并影响了我，是我终身学习的榜样。在生活中给予我关心与照顾，教导我如何为人处事，这将永远地指引着我的人生，至此论文完成之际，向我的导师左玉柱副教授致以崇高的敬意和衷心的感谢！在攻读硕士学位期间，感谢所有教育过我的老师，你们传授的专业知识是我完成本论文的基础，感谢刘宝京师兄、邸晶美师姐，罗尚星师姐对我试验的指导和帮助，感谢同届同学以及我的舍友对我学习和生活的帮助和支持，感谢师弟们对我试验的支持和帮助。此外还要感谢我的家人多年来对我学业的支持和理解，你们给我生活上的关怀和精神上的鼓励是我学习的动力！借此机会，谨向所有关心、支持和帮助我的老师、同学、家人和朋友们表示深深的感谢！44 猪肠道抗PEDV乳酸菌株筛选及其体外抗病毒作用学位名称:兽医硕士研究领域:不区分研究领域研究生:郑常龙指导教师:左玉柱乳酸菌是目前已发现的对人和动物最安全的一类益生菌，它们在生理活动中产生一系列的抗菌物质，这类物质诸如有机酸、H2O2以及细菌素等，能促进宿主的生理活动作用。大多数的乳酸菌是益生性的，在宿主的机体受到病毒、病原等有害物质攻击时，通过唤醒免疫系统来对宿主的机体起到保护作用。到目前为止，益生类乳酸菌就能在某些情况之下产生抗病毒作用，如引发腹泻的轮状病毒。乳酸菌在改善消化系统的功能、降低胆固醇、促进杀死体内的毒素、提高免疫系统活性中起到重要的作用。在肉鸡饲养领域，经过大量的研究表明，这类细菌的作用效果受很多因素的影响，比如消化道的菌群分布状况，消化道的结构、有机体的发育状况以及免疫系统活性等。但是乳酸菌不同的产物的作用效果也不一样，例如菌粉和菌液在控制大肠埃希菌的数量上有着不同程度的抑制作用。近年来我国养猪业发展较快，但总体水平不高，主要表现在母猪的出栏生猪数量降低，造成养猪业生产水平低下的主要原因是仔猪死亡率高。仔猪死亡率占全程死亡率的70%以上，而腹泻引起的死亡数占仔猪死亡数的50%以上，其中引发仔猪高发病率、高死亡率的主要的病原是猪流行腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）。预防和治疗该病毒是现在急需解决的难题，该选题对今后运用乳酸菌预防PEDV具有重要的意义。本课题从益生菌抗病毒研究基础上，从健康的仔猪粪便中分离具有抗PEDV的活性益生菌，并且对其进行鉴定。实验在体外细胞的环境下进行，并采用MTT比色法，TCID50法以及间接免疫荧光法对初筛猪源益生菌抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）的效果进行评估。最终筛选出具有抗PEDV作用的乳酸菌。试验利用MRS培养基先从猪粪便中分离出具有益生菌特性的菌株。然后通过MTT比色法初步筛选出具有抗病毒作用的乳酸菌。对分离的乳酸菌进行体外的耐酸耐胆盐试验，从中选出可以进行体外试验的乳酸菌作为备用菌种。对乳酸菌进行生化试验以及16SrDNA鉴定出菌株的种属。接下来进行体外乳酸菌的抗病毒试验。首先对分离得到的乳酸菌测其生长曲线，从而判断菌株的生长特性，选择最佳的收获时间为18h。然后测定乳酸菌的细胞毒性，三株乳酸菌菌体的最大无毒剂量为1011CFU/mL。乳酸菌代谢产物最大无毒剂量是乳酸菌在108CFU/mL浓度下代谢产物1:2的稀释。在后期试验以最大无毒剂量为起点对其进行稀释，排除细菌本身对细胞的影响，从而达到试验的准确性。接着将分离鉴定的菌株进行体外的抗病毒试验。以乳酸菌的最大无毒剂量为起点将其进行稀释成不同浓度进行试验。试验在体外Vero细胞上进行。乳酸菌或其代谢产物通过三种方式（先加入益生菌或代谢产物后加入病毒；乳酸菌或者代谢产物和病毒同时加入；先加入病毒再加入益生菌或代谢产物）来评估PEDV对细胞的抑制作用。我们把50%组织细胞感染量也可以称为TCID50半数组织培养感染剂量。对病毒滴度的检测方法有很多，然而最常用的则是检测半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(CPE)的病毒量。在本次实验中，将PEDV与分离的乳酸菌共培养，然后检测病毒的TCID50，通过与对照组未接入乳酸菌PEDV的TCID50进行比较，最终确定乳酸菌是否对PEDV具有抑制作用。免疫荧光技术在细菌与病毒检测的实验中是一种常见方法。利用间接免疫荧光法检测益生菌处理细胞后再感染病毒的效果，同时设立病毒与空白对照。一抗工作浓度为1:100，二抗工作浓度为1:500。通过观察荧光的数量来判定益生菌的抑制作用。试验先从猪肠道内容物中分离出36株乳酸菌，通过筛选鉴定最终获得三株乳酸菌分别为植物乳酸菌、 粪肠球菌、戊糖片球菌进一步的抗病毒试验。MTT法结果显示，乳酸菌菌体不同接入顺序抑制率比较中看出菌体先处理组的抑制率效果比其他两组的抑制效果好。而乳酸菌代谢产物不同接入顺序的抑制率对比中可以看出代谢产物和病毒同时接入组要比其他的两组抑制率高。从不同浓度的菌体或者代谢产物处理病毒中看出，乳酸菌对PEDV的抑制率受到乳酸菌浓度的影响很大，随着浓度的降低，抑制率也会随之降低。TCID-3.76、10-3.82、10-3.15，与对50检测病毒毒力结果显示，通过益生菌处理后的TCID50/100ul分别为10照组未经过处理组病毒TCID-4.16）作对比，均有不同程度的降低，说明了乳酸菌对病毒的毒力50/100ul（10具有显著的抑制作用。间接免疫荧光法检测结果显示，加入益生菌及其代谢产物的处理组荧光数量和病毒对照组对比均有不同程度的降低，说明益生菌和代谢产物对PEDV吸附细胞具有一定的阻断作用。成功从健康仔猪粪便中分离得到36株具有乳酸菌特性的菌株，从中选取3株菌株分别为植物乳杆菌，为粪肠球菌，戊糖片球菌进行抗病毒试验。得出三株菌对PEDV在Vero细胞上的增殖有不同效果的抑制作用，其中不同的浓度也有一定的抑制效果。为今后研制抗PEDV的乳酸菌制剂提供一些理论依据。关键词：乳酸菌；猪流行性腹病毒；分离鉴定；抗病毒