苜蓿青贮饲料中优良乳酸菌菌株的筛选

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1、牧草2014·11/12SPECIALISSUEFORFORAGE专辑苜蓿青贮饲料中优良乳酸菌菌株的筛选李旭娇，玉柱（中国农业大学草地研究所，北京 100193）中图分类号：S823.4文献标识码：A文章编号：1004-4264（2014）11/12-0037-04摘要：本研究从苜蓿（MedicagosativaL.）青贮饲料中分离得到若干株乳酸菌，对所有菌株进行生长曲线和产酸速率测定，发现其中8个菌株产酸速率较快，能于24h内将培养基pH值降至4.0以下。根据形态、生化鉴定及16SrDNA同源性序列分析，鉴定4株为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum），2株为

2、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus），1株为类植物乳杆菌（Lactobacillusparaplantarum），1株为副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）。通过适当的工艺处理其有望作为乳酸菌添加剂单独或混合添加入青贮中以提高青贮饲料品质。关键词：青贮；乳酸菌；筛选[1]乳酸菌制剂是青贮制作中常用的生物添加剂。牧培养箱、尼康生物显微镜80i、超净工作台、高压蒸气[2]草表面附着乳酸菌数量往往较少，不能满足青贮所需。灭菌锅、旋涡混合器。乳酸菌制剂的使用可增加青贮初期发酵时的乳酸菌数1.3培养基与试剂量，对保证青贮饲料尽快进入乳酸发酵阶段非

3、常有效，MRS固体培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物从而使pH值迅速下降，蛋白水解作用减弱，青贮饲料10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，[3]中氨态氮含量减少。国外关于青贮用乳酸菌制剂的研柠檬酸二铵2.0g，Tween80.1mL，K2HPO4.2.0g，[4,5]究比较成熟，但国内的研究主要集中在应用方面和实MgSO4·4H2O.0.25g，琼脂15.0g，蒸馏水1.L，pH值[6,7]验室分离鉴定阶段，较少进入市场流通并广泛应用。6.2~6.5，121℃灭菌15.min。本研究旨在提取出优质的乳酸菌菌株从而为青贮实践提产酸培养基采用MRS液体培

4、养基（MRS固体培养供一定的技术指导。基中不加琼脂即可）。革兰氏染色液由北京奥博星生物技术有限责任公司提供。H2S产生试验、硝酸盐还原试1材料与方法验、耐酸耐盐试验及各种碳水化合物水解试验的培养基1.1青贮饲料样品等均购于浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产的细两个样品分别来自不同的苜蓿青贮，南疆地域的标菌微量生化反应管。细菌基因组DNA提取试剂盒（离心为N，图牧2号的标为TII。柱形）DP302购自北京天根生物技术有限公司。1.2仪器设备1.4试验方法精密pH计PHS-2F、722-分光光度计、电热恒温1.4.1.乳酸菌的分离纯化在无菌条件下称取苜蓿青贮饲料样品10g，分别置收稿

5、日期：2014-05-12基金项目：国家牧草产业技术体系（CARS-35）；国家科技支撑计划于装有90mL无菌生理盐水的锥形瓶摇匀，即为稀释10倍的项目（2011BAD17B02）；公益性行业（农业）科研专项-1-7样品悬液，按照10到10进行梯度稀释，选取适当浓经费项目（201303061）。.作者简介：李旭娇（1990-），女，汉族，山西高平人，硕士研究生，度的菌液1mL注入平板，加入约15mL适宜温度的MRS研究方向为饲草加工研究。通讯作者：玉柱。固体培养基，待冷却凝固后倒置于37℃恒温培养箱中。37牧草2014·11/12专辑SPECIALISSUEFORFORAGE48h

6、后计数并挑选典型菌落进行连续纯化培养若干代直TⅡ-3、.TⅡ-4四株乳酸菌降低培养基pH值的速率更到经革兰氏染色为阳性、镜检结果为单纯菌株时再进行快，且产酸速率呈现N5>.N3>TⅡ-3≈TⅡ-4的趋势。过氧化氢酶试验。凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试但是在15h时8株菌均将其所在培养基的pH值降至3.9左验阴性的菌株即可初步确定为乳酸菌，将其接种到MRS右。在15～24h时，培养基的pH值继续下降，除N3、固体斜面培养基，4℃冰箱中保存备用。N5两株菌降至3.83附近，其余6株菌均降至3.75左右。1.4.2.优良乳酸菌菌株的筛选总体来说，8株菌的产酸能力都较强。将经提纯的乳酸菌

7、菌株从MRS固体斜面培养基上对8株产酸能力较强的乳酸菌进行生长曲线的测接种到MRS液体培养基中进行连续三代活化。经活化后定，其生长曲线如图2。8株菌均在2～4h时开始进入对的乳酸菌按3%的接种量转入MRS液体培养基中，37℃数生长期，在3～9h生长速度达到最快，于大约12h开恒温培养。每隔3h取样直到24h，测定发酵液的pH值及始进入稳定期，此后OD值变化较小，但都有增加的趋在波长620nm下的吸光度值，以发酵时间（h）为横坐势。8株乳酸菌的生长曲线与产酸速率曲线基本