维骨力对体外兔关节软骨细胞增殖的影响

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1、万方数据万方数据．376·的细胞汇合。即进行细胞传代。吸除培养液，PBS清洗后．加入0．25％的胰蛋白酶4“。37℃消化2。3min．倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞间隙增加后。立即加入5IIllDMEM细胞培养液以终止消化，细胞刮轻轻刮下培养皿底部细胞．并收集到离心管内，100m／min、10min离心，弃上清液，PBS洗涤2次，离心收集，血球记数板计数。DMEM培养液稀释至2×1昕IIll．以lIIll分别接种于培养瓶中．加入5m1细胞培养液。置于37℃、5％CO：培养箱中培养。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞

2、生长情况．2。3天换液1次。待软骨细胞铺满瓶底后。进行传代。1．2．2Mfrr法检测软骨细胞增殖按参考文献【4】．取消化传代后的软骨细胞．用DMEM培养液制成2×106，“的细胞悬液．接种子96孔培养板中，置于37℃、5％CO：培养箱中培养。24h后软骨细胞贴壁．接种细胞的培养孔随机分为3组．加入相应的培养液100¨l。分组及处理方法如下：10组(空白调零组)，未接种软骨细胞，只加100¨l含10％胎牛血清的DMEM液；I组(空白对照组)，加100¨l含10％血清的DMEM；II组f实验组)，加含2％维骨力的培养

3、液。取培养48h的96孔培养板．每孔加入50m咖l的M11’20以，置于培养箱中孵育4h后吸弃上清液，尽量使残余液减少，然后每孑L加200以DMs0，振荡混合仪上振荡15min．全自动酶标仪上以调零孔调零．490nm波长测各孑L光吸收值(0D值)。1．2．3体外培养兔关节软骨细胞合成代谢功能的检测3H—TdR掺入法检测软骨细胞DNA合成，3H—Pro掺入法检测软骨细胞胶原合成。用1lIll注射器分别抽取100ul3H—TdR和3H—Pro(3H—TdR及3H—Pro购买时浓度为(1mci，m1)，配制成50¨ci

4、／lIll3H—TdR和3H—Pro。根据试验前设计．按每孔20¨I(即l仉Ci3H_TdR和3H—Pr01的量加入3H-TdR及3H—Pm。置于37℃、5％C02孵箱中培育12h。收集、固定细胞：用移液管将待测各孔的培养液按顺序吸出并置入相应的试管内：往各孔内加入少量的0．25％胰蛋白酶溶液。并同时吹打细胞，使贴壁细胞消化脱落．消化不少于5IIlin，形成细胞悬液．将细胞悬液再依次加入上面的相应试管内：将真空泵与玻璃纤维滤膜连接：用滴管依次将试管中的液体吸尽，滴加在玻璃纤维滤膜上。真空抽吸过滤；用注射器分别依次

5、抽取2Inl5％三氯乙酸(细胞固定)、5柚垦型曩塑!坠逊鱼呈坐丛因!△坠艘堕2四墨，y壁!堑，盟鲤蒸馏水f洗去多余的，H—TdR或3H—Pro)、lIIll无水乙醇(细胞脱色)，依次加至滤膜，使细胞固定在滤膜上：待真空泵将滤膜上的液体吸尽后，用镊子将滤膜取下，有序地置于托盘内。3H—TdR和3H—Pro掺入值的测定：将固定细胞的滤膜依次置人对应的装有闪烁液的小塑料瓶内．闪烁液要覆盖滤膜：用美国产BECKMANLs6500multi—purpose液闪仪测定各孑L细胞3H—TdR或3H—Pro的掺人值。1．3统计学

6、处理。计量资料用均数±标准差占±s1表示。采用SPsS13．0及Excel进行统计分析．实验组与对照组的比较采用方差分析或非参数检验．P

7、-34、20．60、19．42，绘出体外培养兔关节软骨细胞生长曲线见附图。计数(10000，Hdl123456789lOll12天附图兔软骨细胞生长曲线2．2MTT法检测结果检测结果(附表)显示，与对照组比较，维骨力组对关节软骨细胞增殖作用有显著性差异(P<0。011，可促进兔关节软骨细胞增殖。2．33H—TdR和3H—Pm掺入测定结果sH—TdR的掺入情况：检测结果(附表)显示．与对照组比较。维骨力组，H—TdR的掺入值有显著性差异(R0．01)。3H-TdR掺入值提高，提示随培养时间的增加，DNA的合成更加旺

8、盛，细胞数量增加。3H—Pm的掺人情况：检测结果(附表)显示，与对笛幻蝤m5O万方数据塞堕与笪堕匡笔2008年8月第26卷第4期附表维骨力对体外培养关节软骨细胞增殖、DNA、胶原合成的影响6血)+与正常组比较，P