抗创伤弧菌mAb的制备与鉴定.doc

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1、抗创伤弧菌mAb的制备与鉴定【摘要】　　目的：制备抗创伤弧菌mAb并用于创伤弧菌感染的快速诊断.方法：用灭活创伤弧菌免疫Balb/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗创伤弧菌的mAb,ELISA法用于mAb的Ig效价,亚类及特异性鉴定.结果：获得了2株可持续分泌抗创伤弧菌mAb的杂交瘤细胞株.结论：获得的高特异性的抗创伤弧菌mAb不仅为创伤弧菌感染的快速诊断奠定了坚实的基础,而且为其进一步的治疗方面的研究提供了理论依据.【关键词】弧菌创伤抗体单克隆杂交瘤　　【Abstract】AIM：Topreparemonoclonalantibody(mAb)againstVibriovulnific

2、usandevaluateitsrolesinrapiddiagnosisforVibriovulnificusinfection.METHODS：Balb/cmicewereimmunizedbyinactivedVibriovulnificus.Anti-VibriovulnificusMcAbswerepreparedbyusinghybridomatechnique.TheELISAwasusedtoidentifyIgsubgroup,titersofascites,relativeaffinityandthespecificityofMcAbs.RESULTS：Twoc

3、elllinesofhybridomawereestablishedandtheyconstantlysecretedhighqualityMcAbssteadily.CONCLUSION：TheMcAbsestablishedcouldbehighlyspecificforVibriovulnificus,whichnotonlylaysasolidfoundationfordevelopmentofarapidmethodfordetectionofVibriovulnificusinfectionbutalsoprovidesthetheoreticalbasisforfur

4、therinvestigationofthetreatment．　　【Keywords】vibriovulnificus;antibodies,monoclonal;hybridomas　　0引言　　创伤弧菌是一种嗜盐弧菌，存在于海水中，广泛存在于海水及海产品中.人体可通过生食海鲜或经过肢体破损创口接触海水、海产品而受其感染［1-3］，见于海上劳作的渔民及驻海演习人员，常见的是发生下肢创伤弧菌感染所致的脓毒血症，以及败血症引起的内毒素性休克.创伤弧菌发病特点起病急,死亡率高［4-6］.因此，快速准确的创伤弧菌早期诊断是指导临床正确用药从而达到理想治疗效果的有力保证；同时，目前对于创

5、伤弧菌的治疗手段仍为经验性的抗生素应用［6-7］.然而，随着细菌对抗生素逐渐出现的不同程度的耐药现象，找到一种非大剂量应用抗生素的治疗感染也成为亟待解决的问题.mAb用于疾病的诊断及治疗已在医学领域得到广泛开展，并收到了很好的效果.作为我国海域主要致病菌之一的创伤弧菌，至今未见有诊断与治疗的mAb制剂问世，为了解决该菌感染的诊断及防治问题，本研究对其mAb进行了研究.　　1材料和方法　　1.1材料4实验所用创伤弧菌标准菌株由第四军医大学解剖学与组织胚胎学教研室黄威权教授惠赠.骨髓瘤细胞Sp2/O由本室保存.Balb/c小鼠，雌性，6～8周龄，体质量18～20g，购自第四军医大学实验

6、动物中心.HRP-羊抗鼠IgG购自华美生物工程公司.Ig亚类鉴定试剂盒购自Sigma公司.　　1.2方法　　　1.2.1抗创伤弧菌mAb的制备以10mL/L甲醛溶液灭活创伤弧菌为免疫原，初次免疫后3,5wk再次免疫，最后一次免疫的第3日取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/O进行融合，间接ELISA法筛选阳性克隆后，有限稀释法进行克隆化，腹水的制备采用常规方法［7］.　　1.2.2mAb的鉴定①效价测定:将甲醛灭活过的创伤弧菌菌液稀释至1×1011个/L包被酶标板，分别加入不同浓度稀释的腹水，孵育后加入HRP-羊抗鼠IgG，最后加入OPD显色后，H2SO4终止反应后测A492nm值.实验中以

7、免疫的小鼠血清为阳性对照，正常小鼠血清为阴性对照.②Ig亚类鉴定利用Sigma公司Ig亚类鉴定试剂盒检测2株阳性杂交瘤细胞的培养上清.③相对亲和力检测用灭活的创伤弧菌菌液以10mg/L包被酶标板，加入倍比稀释的mAb，孵育后加入HRP-羊抗鼠IgG，OPD显色，H2SO4终止反应后测A492nm值，绘出2条反应曲线，以每条曲线上部平坦段（抗原抗体结合平台期）的A值作为100％，然后以曲线上取得50％A值时的相对应抗体浓度用于比较mAb相对亲和力.④与其他常见鱼病致病菌