脂滴自噬在斑马鱼脂代谢中的功能研究

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1、2018届研究生博士学位论文分类号：学校代码：10269密级：学号：52141300006EastChinaNormalUniversity博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：脂滴自噬在斑马鱼脂代谢中的功能研究院系：生命科学学院专业：动物学研究方向：水生动物营养学指导教师：杜震宇教授学位申请人：王晶2018年5月2018届研究生博士学位论文分类号：学校代码：10269密级：学号：52141300006EastChinaNormalUniversity博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：脂滴自噬在斑马鱼脂代谢中

2、的功能研究院系：生命科学学院专业：动物学研究方向：水生动物营养学指导教师：杜震宇教授学位申请人：王晶2018年5月华东师范大学博士学位论文Dissertationfordoctoraldegreein2018StudentID:52141300006Universitycode:10269EastChinaNormalUniversityTitle:ThestudyontherolesoflipophagyonlipidmetabolisminzebrafishDepartment:LifeScienceMajor:ZoologyResearchdirecti

3、on:AquacultureNutritionSupervisor:Prof.ZhenyuDuCandidate:JingWangMay,2018王晶博士学位论文答辩委员会成员名单姓名职称单位备注李家乐教授上海海洋大学主席周歧存教授宁波大学庄平研究员东海水产研究所杨嘉龙研究员华东师范大学陈立侨教授华东师范大学华东师范大学博士学位论文摘要鱼类脂肪沉积是当前养殖鱼类普遍发生的营养性病症，但由于鱼类的脂代谢及其调控机制，尤其是分解机制至今尚没有得到深入阐明，大大阻碍了养殖鱼类脂肪沉积人工调控技术的发展。与鱼类相比，哺乳动物脂分解代谢调控机制的研究相对完善。目前在哺乳

4、动物上已经阐明，脂分解方式不仅仅局限于脂肪水解，脂滴自噬近年来也被认为是除脂解之外的重要降脂途径。脂滴自噬是指通过溶酶体－自噬通路参与脂滴降解的一个细胞过程，且在脂代谢及能量平衡中发挥了极为重要的作用，我们猜想，脂滴自噬或许可以作为一种降脂途径来改善鱼类的体脂沉积问题。然而，迄今为止，在鱼类中尚没有关于脂滴自噬的针对性研究。因此，基于已有的研究，本论文试图回答以下几个科学问题：（1）脂滴自噬是否存在鱼类中？（2）脂滴自噬是否参与了鱼类脂代谢调节？（3）脂滴自噬与脂肪水解之间存在怎样的关系？在本文的研究中，以斑马鱼和斑马鱼肝脏细胞系（ZFL）为实验对象开展了鱼类

5、脂滴自噬的研究。通过电镜、LC3免疫荧光与蛋白印迹等证据证明鱼类中是否存在脂滴自噬现象。通过对同位素标记脂肪酸在自噬受抑制的细胞和活体中的去向追踪、能量呼吸率和相关基因/蛋白表达的测定，并结合转录组学数据分析，验证脂滴自噬在鱼类脂代谢中的功能。药物处理细胞模型用于阐明脂滴自噬／脂肪水解引起的与脂分解代谢相关的生理生化及分子特征变化，进行对脂滴自噬与脂肪水解之间关系的初探究。本文主要的研究结果和结论如下：1脂滴自噬的存在性验证脂滴自噬作为一种新的去脂方式参与了哺乳动物脂代谢调节及能量平衡过程。然而，脂滴自噬在鱼类脂代谢中的作用还不清楚。为了探究脂滴自噬在鱼类脂代

6、谢中的功能，本工作首先对鱼类脂滴自噬的存在进行了验证。目前对于自噬的检测主要是基于检测自噬体的直接（电镜形态观察）和间接（自噬标志蛋白）方法。微管相关蛋白1轻链3（LC3）参与了自噬体的形成，在哺乳动物中是一I华东师范大学博士学位论文个可信的自噬标记物。我们发现饥饿显著性地激活了斑马鱼细胞LC3的mRNA表达水平，同时通过蛋白印迹发现饥饿诱导了LC3-II蛋白含量的增加。这些结果显示饥饿诱导了斑马鱼细胞自噬的发生。为了确定是否是脂滴自噬，我们通过扫描共聚焦显微镜观察在这一过程中脂滴是否与自噬标志蛋白LC3发生了联系。结果显示，在饥饿的状态下，脂滴和自噬标志蛋白

7、LC3发生了共定位，这说明饥饿诱导斑马鱼细胞脂滴自噬的发生。随后，我们又通过电镜进行了进一步的验证。透射电子显微镜是验证自噬是否存在的金指标，也是最经典的方法。自噬是一个动态过程，包括自噬的起始、自噬泡的形成、膜的延伸及自噬体的成熟、自噬体与溶酶体的融合等。在这一连续的过程中涉及了几个与膜相关的结构－多层膜结构的自噬泡、双层膜结构的自噬体和单层膜结构的自噬溶酶体。脂滴自噬属于选择性自噬的一种，指自噬体包裹的待降解内容物是脂滴。因此，通过电镜对脂滴自噬的检测标准，就是是否在自噬体／自噬溶酶体内观察到脂滴。在本工作中，我们通过透射电镜观察到了与脂滴自噬相关的超微结

8、构－与脂滴“接触”的多层膜自噬泡以及包