5-氮-2′-脱氧胞苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡研究.doc

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1、5-氮-2′-脱氧胞苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡研究【摘要】　　［目的］探讨5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）诱导膀胱癌EJ细胞凋亡机制。［方法］以不同浓度的5-Aza-CdR作用于膀胱癌EJ细胞，以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖程度，原位凋亡细胞检测技术(TUNEL)和流式细胞术(FCM)检测5-Aza-CdR对膀胱癌EJ细胞凋亡和细胞周期的影响。［结果］EJ细胞加入不同浓度的5-Aza-CdR（0.625，1.25，2.50，5.00mg/ml），与对照组相比各组EJ细胞增长速度减慢。与对照组相比，不同浓度的各组

2、5-Aza-CdR（0.625，1.25，2.50，5.00mg/ml）可以显著降低EJ细胞的增殖比和增高EJ细胞的凋亡指数(P<0.05)，且与5-Aza-CdR呈浓度依赖关系(P<0.05)；不同浓度的5-Aza-CdR作用EJ细胞后G0/G1期细胞明显增加(P<0.05)。［结论］5-氮-2′-脱氧胞苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡并使EJ细胞阻滞于G0/G1期，从而抑制膀胱癌EJ细胞的增殖。【关键词】5-氮-2′-脱氧胞苷　膀胱肿瘤　凋亡　　StudyonEJCells’ApoptosisInducedby5-Az

3、a-2′-decxycytidine（5-Aza-CdR）5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-decxycytidine，5-Aza-CdR）是一种特异性甲基转移酶抑制剂，通过去甲基化作用可使多种CpG岛高甲基化的抑癌基因重新表达，恢复抑癌功能。但5-氮-2′-脱氧胞苷是否可以通过诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗肿瘤尚少见报道。本研究以膀胱癌EJ细胞株为研究对象，以不同浓度的5-Aza-CdR作用于EJ细胞，观察5-Aza-CdR对EJ细胞凋亡和细胞周期的影响，为膀胱癌的治疗提供新的线索。1材料与方法1.1材料膀胱癌细胞株EJ细胞购自

4、北京大学泌尿外科研究所。5-Aza-CdR购自Sigma公司；PRMI1640培养基、新生牛血清购自GIBCO公司；原位凋亡细胞检测技术（TdT-mediateddUTPnick-endlabeling，TUNEL）试剂盒购自武汉博士德公司。其它试剂均为分析纯。1.2实验方法细胞培养：将复苏的EJ细胞培养于含10%新生牛血清的PRMI1640培养基中，37°C，100%湿度，5%CO2，95%空气，每24h换液1次。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖程度:4将培养的EJ细胞按随机原则分为对照组与实验组。当细胞达到亚融合状态时，常

5、规制成单细胞悬液，以5000个/孔将细胞接种于96孔板，每组4个平行孔。培养24h后，4℃冰箱2h，使细胞同步化。弃去培养液每孔按分组要求分别加入不同量的5-Aza-CdR(1mg/ml)及无血清培养液，使各孔的终体积均为200μl，各组5-Aza-CdR的终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml,每一浓度重复4孔。37℃,5%CO2，培养48h后弃去培养液，各孔加入MTT20μl(5mg/ml)，37℃孵箱4h；各孔加入二甲基亚砜150μl，避光振荡10min，酶标仪640nm波长测定各孔吸光值，以增殖比（pro

6、liferationratio）表示增殖程度（增殖比=实验组吸光值/对照组吸光值×100%）。原位凋亡细胞检测技术检测细胞凋亡：采用六孔板盖玻片培养法，调整细胞密度至5×104/孔，培养24h后，吸弃培养液，每孔按分组要求分别加入不同量的5-Aza-CdR和无血清培养液，使各孔的终体积均为2ml，每组4个平行孔，各组5-Aza-CdR的终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml。37℃，5%CO2，培养48h后，以4%多聚甲醛固定，按原位凋亡细胞检测试剂盒中说明书进行操作，细胞核呈棕黄色染色判定为凋亡细胞。光镜下随机

7、选取10个视野计数1000个细胞。凋亡指数（apoptoticindex，AI）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。流式细胞术（flowcytometry，FCM）检测细胞周期时相变化：用培养瓶培养细胞，按照随机分组原则，将培养的细胞分为5组：空白对照组加入2ml无血清培养液，另4组加入2ml5-Aza-CdR(1mg/ml)，每组4个平行孔，各组5-Aza-CdR的终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml。细胞经24h培养后，胰酶消化，70%冷乙醇固定，碘化丙啶(PI)避光染色，用FACSort型流式细胞仪进行细胞

8、周期的分析。1.3统计分析采用SPSS10.0软件包进行统计分析，方差分析组间差异（t检验）。2结果2.1MTT法检测细胞增殖程度5-Aza-CdR对EJ细胞的增殖有抑制作用，加入5-Aza-CdR后，与空白对照组相比，不同浓度5-A