紫杉醇对膀胱癌ej细胞株增殖抑制及诱导凋亡的作用论文

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1、紫杉醇对膀胱癌EJ细胞株增殖抑制及诱导凋亡的作用论文郭春龙黄艳丽朱晓敏张春阳冯禄王赞滔姜华茂【关键词】紫杉摘要：目的：探讨紫杉醇体外抑制膀胱癌EJ细胞株及诱导凋亡的作用。方法：体外培养膀胱癌EJ细胞株，以不同浓度紫杉醇处理12～72h后，通过MTT法测定细胞生长抑制作用，采用电镜观察和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：紫杉醇能抑制EJ细胞的生长，并在一定剂量和时间范围内呈现出明显的时间、浓度依赖关系。电镜下凋亡细胞体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成花瓣形。电泳见出现典型的凋亡DNA梯形带。结论：紫杉醇能抑制膀胱癌EJ细胞株的生长，诱导凋亡可能为其抗

2、肿瘤作用机制之一。关键词：紫杉醇；膀胱癌；细胞凋亡膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤.freell)；L谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸钠1mmol/L购自华美公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司。12细胞培养人膀胱癌EJ细胞株购自上海午立生物有限公司，培养于含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素、链霉素的培养基中，在37℃、5％CO2培养箱内常规传代培养。取对数生长期细胞用于实验。13实验分组对照组：不加药，每天更换1640全培养液。实验组：紫杉醇浓度分别为10、50、100、500nmol/L，接种细胞24h进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药

3、物浓度恒定。14细胞毒性分析应用MTT比色法测定不同浓度紫杉醇对EJ细胞增殖的影响，并绘制剂量效应曲线。将对数生长期的EJ细胞以0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，细胞数为2×104/ml接种于96孔培养板。接种细胞24h进入对数生长期后开始加入不同终浓度的紫杉醇，每浓度设4个复孔，并设对照孔。置于37℃含5％CO2孵箱中分别培养12、24、48、72h后每孔加MTT（5mg/ml）20μl。作用4h后弃上清，各孔加入100μlDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度A值。细胞生

4、长的抑制率（％）＝（对照组A值－实验组A值）/对照组A值×100％［2］。15透射电子显微镜观察取对照组及实验组细胞（细胞数量为106～107）倒出瓶中培养液，用PBS液（0.01mol/L，pH7.2）洗3min×3次，后加入2.5％戊二醛4℃放置10min。用接种环刮下细胞移入离心管中，2000r/min离心15min。用接种环刮起细胞块，将细胞块与戊二醛一起转移到青霉素小瓶中，4℃放置2h。用PBS洗3min×3次（注意加液时一定不要冲散细胞团块），1％锇酸在4℃固定1h。PBS洗3min×3次，脱水（50％、70％、80％、90％、100％乙醇各1次15

5、min/次；100％丙酮2次，10min/次）。吸弃瓶中的脱水剂，加3ml纯丙酮EPON812包埋剂（1：1体积比），室温下放置30min后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1ml室温放置2h或过夜。吸混合包埋剂2滴于2号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注意混合包埋剂，置37℃、45℃分别12h，置60℃24h，修块，制备半薄切片，定位后制备超薄切片，醋酸铅铀染色，透射电镜观察。16DNA提取及电泳分析取对数生长期的EJ单细胞悬液2×106个接种于培养瓶内，24h后待细胞进入对数生长期开始加入不同浓度的紫杉醇，培养48h收集贴壁及悬浮细胞，1000r/

6、min，离心5min，弃培养液，再加入1mlPBS重悬细胞移入1ml微量离心管中，1000r/min，离心5min弃上清。加入50μl细胞裂解液，混匀，于37℃水浴至混合物变得清亮。在高速冷冻离心机中－4℃12000/min，10min，将上清转移至另一微量离心管中。以等体积的苯酚/氯仿（1：1），苯酚/氯仿/异丙醇（25：24：1）和氯仿各抽提一次。在上清中加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积的无水冷乙醇，于－20℃沉淀过夜。在－4℃12000r/min离心10min。收集将沉淀溶入20μlTBE缓冲液，加入1μlRNA酶，37℃保温1h。加入4μl样

7、品缓冲液，混匀，立即加到含有0.4μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶的样品中，室温，于1×TBE缓冲液中5V/cm电压下电泳1h。以标准品100bpDNAlader为对照。紫外分析仪观察实验结果并拍照［3］。2结果21MTT结果随培养基中紫杉醇浓度的增加和培养时间的延长，EJ细胞增殖明显受抑制。50～500nmol/L组作用一定时间后均可产生较强的抑制效应。其中100nmol/L和500nmol/L组分别于72h、48h达到IC50，提示紫杉醇对EJ细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性，见图1。22电镜结果对照组细胞呈梭形，细胞增殖活跃，内可见多个细胞核，染色质

8、分布均匀。实验组细胞体积