白花蛇舌草对膀胱癌ej细胞株的增殖抑制作用及其机制论文

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1、白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞株的增殖抑制作用及其机制论文李雨成王赞滔龙志新刘景汉【摘要】目的研究白花蛇舌草的提取物体外抑制膀胱癌EJ细胞株增殖的作用及其机制。方法体外培养膀胱癌EJ细胞株，不同浓度的白花蛇舌草提取物作用12～72h，通过MTT法检测细胞生长的抑制作用，采用荧光标记的方法检测端粒酶含量。结果随着实验组白花蛇舌草提取物浓度的增加和作用时间的延长EJ细胞的生长抑制率也逐渐增加，且在一定的剂量范围内呈浓度、时间依赖性。流式细胞仪分析表明，在培养72h后和对照组相比，实验组端粒酶的数目随着药物浓度的增高而明显减少并且呈现浓度依赖性。结论白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞的增殖有显著的抑制作用

2、，且在一定的剂量范围内呈浓度、时间依赖性。端粒酶在药物作用后数量的变化很可能成为白花蛇舌草抑制膀胱癌EJ细胞生长的机制。【关键词】膀胱癌；端粒酶；白花蛇舌草第一李雨成(1967).freela公司)。1.1.4主要设备超净工作台(江苏省无锡市净化技术研究所华达净化设备厂)；倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，恒温培养箱(美国INK公司)，台式低温离心机(Sigma公司)，流式细胞仪(美国B.D公司)，旋转蒸发仪(上海机械制造厂)。1.2方法1.2.1细胞培养人膀胱癌EJ细胞株。培养基为RPMI1640，内含10%的胎牛血清及10万U/L的庆大霉素，在37℃，5%CO2孵箱中培养，每3～4

3、d换液传代维持适当的细胞密度，0.25%胰蛋白酶消化细胞。1.2.2实验分组对照组不加白花蛇舌草提取物加一抗和二抗，每天更换RPMI1640培养液。实验组加白花蛇舌草提取物浓度分别为0.5、1.0、1.2、1.5μg/L。接种细胞24h进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。空白组(MTT法不设空白组)不加白花蛇舌草提取物，加等量的PBS(pH7.4)代替一抗和二抗。1.2.3细胞毒性分析用MTT比色法测定不同浓度白花蛇舌草提取物对EJ细胞增殖的影响并绘制剂量效应曲线。将细胞数为2×104/ml呈对数生长期的EJ细胞接种于96孔培养板中，于37℃含5%CO2孵箱中培养2

4、4h，进入对数生长期后，将细胞分成实验组、对照组，实验组加不同浓度中药制剂，每个浓度设5个复孔；对照组加肿瘤细胞不加任何药物，为阴性对照。分别培养12、24、48、72h后每孔加入MTT溶液20μl,作用4h后弃上清，每孔加入二甲基甲砜100μl，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度A值。1.2.4端粒酶的定量检测〔3，4〕将对照组、实验组和空白组共同培养72h。用0.25%的胰蛋白酶消化后收集数量不少于1×106/ml细胞于1mlEp管中，共30个。4℃缓冲液离心洗2次(去上清)。4%多聚甲醛1ml悬起细胞，室温孵育10min，4℃缓冲液洗1次(去上清)

5、。加甲醇1ml/1×106/ml悬起细胞，室温孵育10min。4℃缓冲液洗1次(去上清)。用0.2%TristonX1001ml悬起细胞，PBS洗后4℃离心(去上清)。对照组、实验组加鼠抗人hTERT单克隆抗体(1∶200)稀释液100μl混匀室温孵育30min，4℃缓冲液洗1次(去上清)，空白组加等量的PBS。对照组、实验组加荧光标记的二抗山羊抗兔IgG(1∶200)稀释液100μl悬起细胞,.freelin，用4℃缓冲液离心洗1次(去上清)。空白组加等量的PBS。0.1%多聚甲醛250μl悬起细胞，4℃冰箱保存，24h内上机测试。1.3统计学处理数据用x±s表示，应用单因素方差分析

6、LSD检验的方法进行统计学分析。2结果2.1肿瘤细胞生长抑制率白花蛇舌草提取物作用于膀胱癌EJ细胞72h后，细胞增殖受到明显抑制，且抑制效果随着时间和浓度的增加而增强。并且1.5μg/L浓度组在作用48、72h达到IC50，说明白花蛇舌草提取物对EJ细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性。表1各组肿瘤细胞生长抑制率(略)2.2流式细胞仪检测加药后端粒酶含量MTT法检测发现白花蛇舌草提取物作用于膀胱癌EJ细胞72h各浓度组对肿瘤细胞的增殖抑制作用最强，所以荧光标记法的细胞培养时间为72h。对照组端粒酶含量为42.465±3.987，实验组0.5、1、1.2、1.5μg/L组端粒酶含量分别为3

7、3.580±1.842、25.710±3.222、15.334±2.555、9.118±1.874。各实验组与对照组及空白组(0.016±0.005)比较均有统计学意义(均P＜0.001)。3讨论白花蛇舌草内服用于清热解毒、利湿通淋，对毒蛇咬伤、结肠炎、肠胃溃疡、肝炎、肿瘤、急慢性喉炎有治疗作用，外用治疗疮痈肿毒。现代药理研究表明，白花蛇舌草提取物能激活T细胞，使其释放干扰素γ，杀死肿瘤细胞，具有抗突变、抗烟焦油对淋巴细胞DNA的