蚯蚓纤溶酶抑制胃癌细胞株mgc803 增殖及诱导凋亡的作用

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1、蚯蚓纤溶酶抑制胃癌细胞株MGC803增殖及诱导凋亡的作用【摘要】目的：研究蚯蚓纤溶酶对人胃癌细胞株MGC803抑制增殖及诱导凋亡的作用，并初步探讨蚯蚓纤溶酶诱导凋亡的作用机制。方法：采用MTT法观察蚯蚓纤溶酶对MGC803细胞增殖的影响，DNA凝胶电泳技术观察凋亡细胞变化，流式细胞术观察细胞凋亡率的变化，免疫细胞化学染色法检测蚯蚓纤溶酶对MGC803细胞p53蛋白表达的影响。结果：蚯蚓纤溶酶对胃癌细胞增殖有明显抑制作用，呈剂量依赖性。蚯蚓纤溶酶4uku·ml-1作用于胃癌细胞48h后，DNA琼脂糖凝胶电泳观察到典型梯状条带。蚯蚓纤溶酶浓度分别为2

2、、4、8uku·ml-1作用于胃癌细胞48h后均可诱导细胞凋亡，各组细胞凋亡率分别为（29.51±5.54）％、（61.63±7.12）％、（80.82±5.40）％，与对照组相比，凋亡率升高有统计学意义（P0.01）。蚯蚓纤溶酶2、3uku·ml-1组作用于细胞48h后，p53蛋白表达减少，平均光强度分别为1.299±0.07、1.203±0.06，与对照组相比，差异有统计学意义（P0.01）。结论：蚯蚓纤溶酶在体外可以抑制MGC803细胞增殖，其机制可能与蚯蚓纤溶酶抑制p53蛋白表达并诱导细胞凋亡有关。【关键词】蚯蚓纤溶酶人胃癌细胞细胞凋亡p

3、53蛋白蚯蚓纤溶酶是从鲜蚯蚓中提取的活性成分，在体内外对肿瘤细胞均有杀伤作用，但其作用机制一直未能得到充分阐明。研究表明，蚯蚓提取物在体外对多种人癌细胞株有抑制作用[13]，其抑制肿瘤细胞生长的活性成分主要是纤溶酶和纤溶酶原激活酶。李洪燕等[4]用人胃癌BGC823和人乳腺癌B37裸鼠移植瘤模型对蚯蚓纤溶酶进行体内抗肿瘤药效学观察，显示纤溶酶对两种裸鼠移植瘤生长均有抑制作用。本实验在体外研究蚯蚓纤溶酶对胃癌细胞的抑制作用，并初步探讨其作用机制。1材料和方法1.1材料蚯蚓纤溶酶由南京农业大学免疫生化研究所分离提取，胃癌细胞株MGC803由解放军第

4、81医院全军肿瘤中心传代保存。RPMI1640培养基(GIBCO公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MTT(Amresco公司)，AnnexinVFITC/PI试剂盒(美国BD公司)，鼠抗人p53单克隆抗体、即用型SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)；酶联免疫检测仪（BIORAD550，美国伯乐公司），FACSVantageSE型流式细胞仪(美国BD公司)。1.2方法1.2.1细胞培养MGC803细胞于含10%小牛血清、青霉素100U·ml-1、链霉素150μg·ml-1的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2

5、细胞培养箱内培养。0.25%胰蛋白酶消化传代。1.2.2MTT比色分析取对数生长期的MGC803细胞，用含10％小牛血清的培养液调整细胞浓度为5×104ml-1，接种于96孔板，每孔200μl。37℃、5%CO2恒温培养24h后更换为无血清的RPMI1640培养液，继续培养24h，使细胞同步化。分为实验组(再分为蚯蚓纤溶酶1、2、3、4、5、6、7、8uku·ml-1组)、空白组(不加细胞)和对照组(不加药)，每组设3个复孔，培养48h后每孔加入MTT20μl（5mg·ml-1），继续培养4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150μl终止反应，用酶

6、联检测仪于570nm波长处测定每孔光密度(OD值)，计算细胞生长抑制率，抑制率=[(对照组OD值-空白组OD值)-(实验组OD值-空白组OD值)]/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。以上步骤重复3次。1.2.3DNA琼脂糖凝胶电泳取对数生长期的MGC803细胞消化传代后，实验组加入终浓度为4uku·ml-1蚯蚓纤溶酶，对照组加入等体积的RPMI1640细胞培养液，培养48h后，1000r·min-1离心5min。沉淀细胞加入1×STE缓冲液（含10mmol·L-1TrisHCl，10mmol·L-1NaCl，1mmol·L-1EDTA，

7、pH8.0）0.6ml，10％SDS10μl，20mg·ml-1蛋白酶K10μl，混匀，37℃水浴过夜；次日加入氯仿0.8ml，混匀，37℃水浴过夜；次日再次加入氯仿0.8ml，混匀，室温以8944r·min-1离心10min，吸取上清，加入无水乙醇1.5ml，混匀，室温以8944r·min-1离心10min，弃上清，倒置EP管，干燥，加水50μl重溶DNA，室温放置30min以上，取6μlDNA，进行2%琼脂糖凝胶电泳，观察梯状条带。1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期的MGC803细胞加入终浓度分别为2、4、8uku·ml-1的蚯蚓纤

8、溶酶为实验组，对照组加入等体积的RPMI1640细胞培养液，培养48h，收集各组细胞，每组细胞3个样本。4℃，1000r·min-1离心