荧光素fitc标记抗体的原理和操作方法

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1、荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法中文名称：异硫氰酸荧光素酯中文别名：荧光素-5-异氰酸酯;异硫氰酸荧光酯异构体;异硫氰酸荧光橙红;异硫氰酸荧光红;异硫氰酸荧光黄;异硫氰酸荧光素（同分异构体I）;荧光素5-异硫氰酸盐,异构体1,95%;异硫氰酸荧光素异构体1.95+%;异硫氰酸荧光素英文名称：FluoresceinisothiocyanateisomerI英文别名：Fluoresceinisothiocyanate,isomer1;5-FITC;5-Isothiocyanatofluorescein;FITC;FITC-CEL

2、ITE(R);FITCISOMER;FITC'ISOMERI';FITC,ISOMERI;FLUORESCEINISOMERIISOTHIOCYANATE;2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-5-isothiocyanatobenzoicacidCAS号：3326-32-7EINECS号：222-042-0分子式：C21H11NO5S分子量：389.3807InChI：InChI=1/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24)3-6-16(19

3、)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h1-9,23H,(H,25,26)分子结构：密度：1.46g/cm3熔点：360℃沸点：735.6°Cat760mmHg闪点：398.7°C水溶性：practicallyinsoluble蒸汽压：1.02E-22mmHgat25°C【FITC标记原理】当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个

4、赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下　　FITC-N=C=S+N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质　　常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。　　1．Marsshall法　　(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光　　素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或　　3

5、．0的0．01mol／LPBS等。　　(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。　　②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。　　a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。　　b．总蛋白量(

6、AXB)＝Crag。　　c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。　　d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。　　e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。　　f．PBS量D-(B+F)=Gml。　　注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。　　③结合(或标记)边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白

7、溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。　　④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。　　⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml

8、标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。　　2．Chadwick法　　(1)试剂和材料抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0．01mol/LpH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅