兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定.doc

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1、兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定【摘要】目的：分离纯化鉴定兔高迁移率非组蛋白N2(HighmobilitygroupchromosomalproteinN2,HMGN2)。方法：利用液氮研磨和5%高氯酸从新鲜兔胸腺组织获得酸溶性萃取物，经反相高效液相色谱（RPHPLC）分离得到HMGN2，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblotting对HMGN2进行分子量测定和特异性鉴定。并利用琼脂糖弥散抑菌实验对其杀菌活性进行鉴定。结果：利用上述方法分离纯化出高纯度的兔HMGN2。对大肠埃希菌临床分离株54080、大肠

2、埃希菌ATCC25922有明显杀菌活性。结论：建立简单分离高纯度的HMGN2的方法。【关键词】兔胸腺；HMGN2；分离高迁移率非组蛋白(Highmobilitygroupchromosomalprotein,HMG)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族[9]，这一家族的成员普遍存在于高等真核生物中，目前HMG蛋白分为三个亚家族，分别为HMGA、HMGB和HMGN。HMGN2为HMGN亚家族的成员，其基因位于染色体1q35,相对分子质量为9.2KD，共由90个氨基酸组成。已有研究表明，HMGN2结合于染

3、色体的特异部位，是染色体纤维构成必不可少的部分[2,3]，参与DNA的复制和转录[1]，与转录活性基因有关[5]，能解开致密染色体的折叠结构从而有利于复制和转录的启动[6]。本实验室首次发现HMGN2具有明显的抗菌活性[4]。为了进一步研究HMGN2的生物学功能，我们利用琼脂糖弥散抗菌法鉴定内源性抗菌肽的方法，分离纯化兔胸腺HMGN2。1材料和方法1.1实验材料主要材料:兔胸腺，致病性大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌ATCC25922。主要试剂:丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，TEMED，蛋白质Marker为Merck

4、产品；Tris、Tricine、琼脂糖、大豆培养基、三氟乙酸、溶菌酶、牛血清白蛋白（BSA）为Simga产品；乙腈为Fisher产品；抗HMGN2多克隆抗体为Upstate产品；色谱纯水为Millipore超纯水；考马斯亮兰R250为上海试剂厂进口分装产品；反应试剂盒BCAProteinAssayKit为PIERCE公司产品；其余试剂为国产分析纯。主要仪器：高速离心机（BECKMANCOULTERAvantiJ30I,美国）、反相高效液相色谱仪HP1100(惠普公司)、电泳装置为（BIORADPOWER/PAC3000

5、美国）、UVI凝胶成像系统（英国）。1.2实验方法1.2.1兔胸腺酸溶性萃取物的制备新鲜兔胸腺组织，剪碎，液氮研磨。研磨产物溶于5%高氯酸，冰浴电动匀浆提取酸溶性萃取物，萃取物在3.5KD的透析袋中4℃透析48小时后冷冻干燥，得兔胸腺核蛋白的粗提物[8,7]。放于-70℃保存用于备用。41.2.2反相高效液相色谱分离纯化兔胸腺酸溶性粗提物兔胸腺核蛋白粗提物冷冻干燥后溶于0.1%的三氟乙酸，高速离心后上清液用于RPHPLC经C18柱分离纯化。所用分离条件为：0.1%的三氟乙酸→60%乙晴060分钟线性梯度洗脱，检测波长为

6、214nm,流速为1ml/min。收集每个单峰的洗脱液，真空冷冻干燥后溶于无菌水中进行鉴定。1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳（TricineSDSPAGE）及尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（AUPAGE）初步鉴定HMGN2利用聚丙烯酰胺凝胶电泳初步确定上述各单峰的相对分子量，以及其纯度，所用浓缩胶浓度为4%T、3%C,分离胶浓度为16.5%T、3%C。胶厚0.75nm。电泳条件:80V恒压,3.54小时。电泳完毕后进行考马斯亮蓝染色1小时,脱色过夜后进行观察。1.2.4Westernblotting特异性鉴定HMGN2Tric

7、ineSDSPAGE电泳完毕后，利用半干转移法将胶上条带转移到PVDF膜上，10%BSA封闭1小时膜后，加入HMGN2抗体4℃孵育过夜，次日漂洗后用辣根过氧化酶标记的抗兔IgGHRP室温孵育1小时后，洗涤三次，PVDF膜蛋白面向上，DAB显色液显色后观察试验结果。1.2.5HMGN2对大肠埃希菌的杀菌功能鉴定参照Lehrer等[14]的方法对HMGN2的抗菌功能进行检测:用PBS作为阴性对照，HNP为阳性对照，HMGN2的稀释浓度依次为4、2、1、0.5μg·μl1。37℃孵育过夜，观察杀菌环直径大小判断杀菌功能强

8、弱。实验做三复孔，重复三次。2实验结果2.1HMGN2分离纯化及鉴定新鲜兔胸腺组织酸溶性粗提物经RPHPLC分离后各组分出峰时间如图1所示，主要色谱峰集中在2040分钟。第20分钟的分离物为兔胸腺HMGN2。图2显示经RPHPLC所得的第二十分钟分离物行TricineSDSPAGE电泳后考马斯