兔胸腺hmgn2的分离纯化鉴定

《兔胸腺hmgn2的分离纯化鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定【摘要】目的：分离纯化鉴定兔高迁移率非组蛋白N2(HighmobilitygroupchromosomalproteinN2,HMGN2)。方法：利用液氮研磨和5%高氯酸从新鲜兔胸腺组织获得酸溶性萃取物，经反相高效液相色谱(RPHPLC)分离得到HMGN2,经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblotting对HMGN2进行分子量测定和特异性鉴定。并利用琼脂糖弥散抑菌实验对其杀菌活性进行鉴定。结果：利用上述方法分离纯化出高纯度的兔HMGN2O对大肠埃希菌临床分离株54080、

2、大肠埃希菌ATCC25922有明显杀菌活性。结论：建立简单分离高纯度的HMGN2的方法。【关键词】兔胸腺;HMGN2；分离高迁移率非组蛋白(Highmobilitygroupchromosomalprotein,HMG)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族［9］，这一家族的成员普遍存在于高等真核生物中，目前HMG蛋白分为三个亚家族，分别为HMGA、HMGB和HMGN。HMGN2为HMGN亚家族的成员，其基因位于染色体lq35,相对分子质量为，共由90个氨基酸组成。己有研究表明，HMGN2结合

3、于染色体的特异部位，是染色体纤维构成必不可少的部分［2,3］，参与DNA的复制和转录［1］，兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定【摘要】目的：分离纯化鉴定兔高迁移率非组蛋白N2(HighmobilitygroupchromosomalproteinN2,HMGN2)。方法：利用液氮研磨和5%高氯酸从新鲜兔胸腺组织获得酸溶性萃取物，经反相高效液相色谱(RPHPLC)分离得到HMGN2,经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblotting对HMGN2进行分子量测定和特异性鉴定。并利用琼脂糖弥散抑菌实验对其杀菌活性进

4、行鉴定。结果：利用上述方法分离纯化出高纯度的兔HMGN2O对大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌ATCC25922有明显杀菌活性。结论：建立简单分离高纯度的HMGN2的方法。【关键词】兔胸腺;HMGN2；分离高迁移率非组蛋白(Highmobilitygroupchromosomalprotein,HMG)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族［9］，这一家族的成员普遍存在于高等真核生物中，目前HMG蛋白分为三个亚家族，分别为HMGA、HMGB和HMGN。HMGN2为HMGN亚家族的成员，

5、其基因位于染色体lq35,相对分子质量为，共由90个氨基酸组成。己有研究表明，HMGN2结合于染色体的特异部位，是染色体纤维构成必不可少的部分［2,3］，参与DNA的复制和转录［1］，与转录活性基因有关［5］，能解开致密染色体的折叠结构从而有利于复制和转录的启动［6］。本实验室首次发现丽GN2具有明显的抗菌活性［4］。为了进一步研究HMGN2的生物学功能，我们利用琼脂糖弥散抗菌法鉴定内源性抗菌肽的方法，分离纯化兔胸腺HMGN2。1材料和方法实验材料主要材料：兔胸腺，致病性大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌

6、ATCC25922。主要试剂:丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，TEMED,蛋白质Marker为Merck产品；Tris、Tricine、琼脂糖、大豆培养基、三氟乙酸、溶菌酶、牛血清白蛋白（BSA）为Simga产品；乙腈为Fisher产品抗HMGN2多克隆抗体为Upstate产品；色谱纯水为Millipore超纯水；考马斯亮兰R250为上海试剂厂进口分装产品；反应试剂盒BCAProteinAssayKit为PIERCE公司产品；其余试剂为国产分析纯。主要仪器：高速离心机（BECKMANCOULTERAvantiJ30I，

7、美国）、反相高效液相色谱仪HP1100（惠普公司）、电泳装置为（B10RADPOWER/PAC3000美国）、UVI凝胶成像系统（英国）。实验方法兔胸腺酸溶性萃取物的制备新鲜兔胸腺组织，剪碎，液氮研磨。研磨产物溶于5%高氯酸，冰浴电动匀浆提取酸溶性萃取物，萃取物在的透析袋中4°C透析48小时后冷冻干燥，得兔胸腺核蛋白的粗提物［8,7］。放于-70°C保存用于备用。反相高效液相色谱分离纯化兔胸腺酸溶性粗提物兔胸腺核蛋白粗提物冷冻干燥后溶于％的三氟乙酸，高速离心后上清液用于RPHPLC经C18柱分离纯化。所用分离条件

8、为：％的三氟乙酸一60%乙晴060分钟线性梯度洗脱，检测波长为214nm，流速为lml/min。收集每个单峰的洗脱液，真空冷冻干燥后溶于无菌水中进行鉴定。聚两煤酰胺凝胶电泳(TricineSDSPAGE)及尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(AUPAGE)初步鉴定HMGN2利用聚丙烯酰胺凝胶电泳初步确定上述各单峰的相对分子量，以及其纯度，所用浓缩胶浓度为4%T、3%C，分离胶浓度为%