禽类抗hbv抗体igy检测方法的建立

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1、蛋鸡抗HBV-IgY的制备与酶标检测方法的建立摘要:目的：制备出特异性的抗HBV-IGY抗体,探索ELISA检测条件。方法：用人乙肝疫苗免疫蛋鸡,分别收集鸡蛋,4℃下保存备用;用鸡蛋抗体IgY提取系统（EGGstractIgYPurificationSystem，EIPS）提取鸡蛋黄中IgY抗体;用改进的酶联免疫吸附法检测IgY抗体含量，探索最佳检测条件。结果在免疫后第一至三周,IgY抗体含量开始上升，第六周达到高峰，并可持续两个月，结论采用乙肝疫苗免疫母鸡,，可持续性获得特异性抗HBV-IgY抗体。关键词：乙肝病毒;卵黄抗体；ELISA鸡卵黄免疫球蛋白(Ig

2、Y)具有与血清IgG一样的抗体活性。鸡的IgY类似于哺乳动物IgG，其分子量约为180kb，等电点接近5．2。其重链有4个稳定区，无交链区，而哺乳动物的IgG只有3个稳定区。IgY的含氮量为14．8％，氨基酸组成及含糖量与人和兔的免疫球蛋白有显著的差异。特异性鸡卵黄抗体IgY对病原体感染的防御无动物种属的差异，这为IgY防治人类疾病的应用奠定了基础。乙型肝炎病毒((HepatitisBvirus,HBV)的感染，不仅引起急、慢性病毒性肝炎，而还与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切的关系。接种重组乙肝疫苗或合成肽疫苗能够增强乙肝患者的抗HBV免疫应答，通过接种疫

3、苗对机体施加HBV抗原刺激有助于乙肝的治疗，为探讨禽类抗乙肝病毒卵黄抗体（抗HBV-IgY）的特性，我们利用重组酵母乙型肝炎疫苗，对蛋鸡进行免疫后，用EIPS提取蛋黄中的IgY，利用改进的人乙肝表面抗体检测试剂盒检测所得IgY中HBV-IgY含量变化,为进一步开发应用HBV-IgY做准备。1材料与方法1.1试剂材料重组酵母乙型肝炎疫苗购自北京天坛生物制品股份有限公司，批号；EGGstractIgY：PurificationSystem购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，批号；乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）购自上海科华生物技术有限公司，批号200

4、81006，羊抗鸡-HRP购自；一般化学试剂采用国产分析纯试剂。1.2产蛋母鸡的免疫选择15月龄、体重1.5Kg左右的健康蛋鸡两只采用胸部皮下及双腿肌肉注射疫苗，剂量为10μg/只，每周一次，连续三次后追加一次同剂量静脉注射。收集免疫前至免疫后三个月的鸡蛋，按对应母鸡编号，4°保存备用。1.3IgY的分离提取按EIPS鸡蛋IGY提取系统试剂盒说明，分离蛋黄后加入三倍体积A液搅拌混匀后4℃10000rpm离心15min，纱布过滤，在滤液中加入三分之一倍体积B液再次4℃10000rpm离心15min弃上清得IgY,-50℃真空冷冻干燥后4℃冰箱保存。1.4间接EL

5、ISA法检测抗体抗HBV-IgY抗体采用ELISA法检测，检测前先用PBS将IgY抗体稀释到1：250，羊抗鸡-HRP稀释到1：500.按实验设计依次在乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒96孔板中加入50μl稀释好的IGY样品，50微升羊抗鸡-HRP溶液，混匀，封板，37℃孵育30min后洗板，每孔加入显色剂A液、B液各50微升，混匀，封板，37℃15min后每孔加入50微升终止液混匀，酶标仪450nm波长检测。1结果鸡蛋中抗HBV-IgY免疫前及免疫后各时间点酶联免疫检测吸光度OD值一号鸡免疫前第1周第2周第3周第4周第5周第6周0.81±0.111.27±0.

6、221.1±0.141.06±0.160.92±0.030.94±0.061.17±0.01第7周第8周第9周第10周第11周第12周第13周1.2±0.061.23±0.161.21±0.220.98±0.091.14±0.120.84±0.190.79±0.2二号鸡免疫前第1周第2周第3周第4周第5周第6周0.48±0.050.45±0.10.55±0.030.77±0.10.69±0.050.92±0.050.73±0.09第7周第8周第9周第10周第11周第12周第13周1.03±0.210.86±0.090.77±0.150.96±0.150.85±

7、0.180.51±0.140.55±0.11讨论与结论本研究用重组酵母乙型肝炎疫苗免疫蛋鸡，获得抗HBV-IGY，经初步提取后得到鸡蛋中的总IGY，并利用人乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）结合羊抗鸡辣根过氧化物酶检测总IGY中的抗HBV-IGY。从以上数据可见，免疫后鸡蛋中的抗HBV-IGY明显上升，但是上升的时间，上升的多少，均有差异。并且，免疫前出现较高的数值说明总IGY中非特异性结合比较高，有待进一步纯化抗HBV-IGY。本方法能利用了现有试剂盒达到快速方便地检测出鸡蛋中抗HBV-IGY的变化情况的目的。