抗幽门螺杆菌特异性卵黄抗体igy制备和效果评价

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1、万方数据ADissertationSubmittedtoSichuanAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementforMasterDegreeofSciencePreparationofSpecificAnti-HelicobacterPyloriImmunoglobulininEggYolkandEvaluationofitsPropertiesTingminYangDirectedbyCaoSuizhongAssociateprofessorYa’all

2、，Sichuan，ChinaJune，2014万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：勘V矽～年f月、-日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门

3、或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。埘文不保密。。本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√”)研究生签名：导师签名辐鼢f，釜莎JWl僻f月f明pi≯年<民

4、嵋万方数据抗幽门螺杆菌特异性卵黄抗体IgY的制备和效果评价中文摘要幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，且pylori)是引起胃相关疾病的重要因素，世界卫生组织将其列为I类致癌因子。目前“三联”或“四

5、联”疗法是临床治疗11．pylori相关疾病的主要手段，但是耐药菌株的出现导致该方法的治愈率越来越低，因此开发高效、安全、经济且不会产生耐药性的药物显得尤为迫切和重要。卵黄抗体(Specificeggyolkimmunoglobulin)IgY，是禽类主要的血清免疫球蛋白，国内外研究表明幽门螺杆菌全菌或某类致病因子的重组蛋白制备的抗11．pylori特异性IgY也可以达到治疗感染Hpylori的效果。14．py／on在胃部低pH(<2)情况下利用尿素酶水解从血液中扩散出的尿素为氨水和二氧化碳，在菌体周围形成“氨云”中和胃酸。有利于

6、Hpylori穿过胃黏液层，定植于胃上皮细胞表面。1-1．pylori尿素酶B亚单位是主要的功能单位，包含尿素酶的活性中心。尿素酶膜通道蛋白UreI对幽门螺杆菌在人和动物体内生存起关键作用。本实验在前期对／-／．pylori的ureI和ureB基因的生物学作用进行研究的基础上，成功的制各了抗SSl全菌的IgV和抗重组尿素酶的IgY，拟通过此体外抑茵实验以及体内动物实验来评价两种IgY抗体的治疗效果，为最终制备治疗性抗幽门螺杆菌特异性抗体制剂提供基础研究材料。本实验的研究方法，结果与结论如下：1．制各SSl一IgY和IB—IgY以超

7、破SSl菌液和m重组蛋白为抗原免疫蛋鸡；水稀释法和两次硫酸铵沉淀法分离纯化I“；SDS．PAGE检测纯度，ELISA检测效价，K5600检测浓度。纯化后的两种IgY纯度均超过80％，效价超过1：12800，浓度可达30mNml。2．两种I“体外抑菌效果评价分别将两种特异性IgV与新鲜且pylori菌液混合后涂板孵育，对菌落克隆数进行统计分析。SSl一IgY组和IB-IgY组与生理盐水组相比差异显著，说明两种IgY均可在体外抑制Hpylori的生长。3．两种Igy对尿素酶的抑制作用将新鲜Hpylori菌液超声破碎后得到含有大量尿素酶

8、的溶液，将其分别与万方数据两种IgY混合孵育后进行快速脲酶检测。结果表明两种抗Hpylori特异性I“均有抗尿素酶活性，且SSl．I“的效果更好。4．建立Hpylori感染BALB／c小鼠模型6周龄小鼠，染菌前12h禁食禁水，前10rain用0．2M碳酸氢钠灌胃处理，以0．2ml浓度为1x108cfu／ml的SSl菌液灌胃，共3次灌胃，每次间隔ld。4w后根据革兰氏染色镜检、PCR，快速尿酶试验检测结果判定成功建立了Hpylori感染BALB／c小鼠模型。5．两种IgY在动物实验中对Hpylori的抑制作用将6周龄小鼠随机分为7组

9、，分别为IB—IgY3rag组，6rag组，SSl·IgY3mg组，6mg组，奥美拉唑与克拉霉素联合组，阳性感染组与生理盐水组。与建模时相同的处理方法对实验组小鼠进行细菌灌胃，1w后对小鼠进行治疗。治疗间隔1d，治疗7d，治疗结束后1w进行革兰氏染