rgs1对raw264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节

《rgs1对raw264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节【摘要】目的:研究RGS1基因对细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。方法:通过克隆RGS1基因、转染RAW264.7细胞、建立稳定转染的细胞系,利用流式细胞术检测,基因芯片分析初步探讨RGS1基因的功能。结果:RGS1基因能够抑制NFκB转录因子活性;RGS1基因明显增加RAW264.7细胞表面CD86分子的表达,降低CD80表达;在不同Toll样受体配体刺激后,CD40、CD80和PD1水平低于对照组。同时,RGS1基因使IL6、IL15的表达明显升高,IL10、IL1的表达明显降低。结论:RGS1基因可调节免疫相关细

2、胞表面分子和细胞因子的分泌,影响Toll样受体信号通路,表明RGS1可能在免疫调节方面起重要作用。【关键词】免疫调节RGS1基因免疫相关细胞　　免疫细胞表面刺激分子和由此产生的细胞因子在调节免疫反应过程中起关键作用,对肿瘤免疫,移植排斥反应和自身免疫性疾病的发生、发展、转归有着重要的影响。已经发现免细胞中有多种基因表达的改变［1］。我们前期研究中发现卵巢肿瘤细胞能够导致抗原提呈细胞RGS1上调,提示了RGS1可能在免疫调节过程中起作用。RGS1（regulatorofGprotein）是GTPase激活蛋白,由许多成员组成。这个家族的成员能在免疫细胞如T细胞、13B细胞和树突细胞表达。有研究表

3、明,RGS1基因与趋化因子诱导的免疫细胞迁移有关,从而对免疫功能进行调节［2］。我们通过建立RGS1基因稳定转染的RAW264.7细胞系,观察其对细胞表面分子表达的影响和细胞因子分泌模式的改变外,为RGS1在免疫相关疾病治疗的潜在应用提供实验依据。　　1材料和方法　　1.1材料RAW264.7细胞购自美国ATCC公司。NFκB荧光素酶质粒和NFκB碱性磷酸酶(seap)质粒由美国约翰霍普金斯大学免疫实验室赠与;鼠RGS1pcDNA3.1/V5质粒由本实验室构建;pcDNA3.1/V5HisTOPOTAExpression试剂盒购自Invitrogen公司;PCR缓冲液、dNTPs

4、、Taq、AgaroseGelDNA纯化试剂盒购自TaKaRa公司。LipofectaminTM2000,SuperScript.OneStepRTPCRwithPlatinumTaq购自Invitrogen公司。RNATRIzol试剂购自北京鼎国公司。GreatEscAPeTMSEAP购自Clontech公司。TritonX100,羊抗鼠抗体为Sigma公司产品。Trypsin胰酶（Lot:AMG16843）为HyClone公司产品。OPTIMEMI无血清培养基购自Invitrogen公司。PRMI1640购自HyClone公司。类标准胎牛血清购自兰州民海生物公司。G418硫酸盐

5、,硫酸卡那霉素购自Amresco公司。　　1.2方法13　　1.2.1克隆RGS1基因测序并建立稳定转染的RAW264.7细胞系按照Invitrogen公司提供步骤,从肿瘤相关树突状细胞扩增提取RGS1基因片段并克隆到pcDNA3.1His/V5Topo载体,测序确定RGS1基因。RPMI1640培养基加入100mL/L新生牛血清培养RAW264.7细胞。取4×105细胞加入24孔板培养过夜。1μg鼠RGS1pcDNA3.1/V5质粒溶于50μLOPTIMEM培养基,颠倒混匀。2μLInvitrogenLipofectaminTM2000溶于50μLOPTIMEM培养基,颠倒混匀后室温孵

6、育5min。混合DNA溶液与LipofectaminTM2000溶液,颠倒混匀后室温孵育20min。吸出24孔板中培养基,加入100μL混合溶液培养8h。加入500μL含血清培养基培养24h。用400mg/L浓度的G418和100mL/L血清培养基筛选培养15d。　　1.2.2检测稳定转染细胞系转染率取4×105稳定转染细胞于流式染色管中1600r/min离心5min,弃上清,加入2mLPBS1600r/min离心5min,弃上清,用1mL(1g/L)多聚甲醛固定细胞。加入2mLPBS1600r/min离心5min,弃上清。加入TritonX100室温静置5min,加入2mLPBS1600r

7、/min离心5min,弃上清。染色:2mLPBS1600r/min,离心5min,弃上清后加入100μLPBS吹散细胞,用1g/L多聚甲醛固定,然后1g/LTriton穿透,加入1μLFITC标记的antiV5抗体,避光放置15min。加入2mLPBS1600r/min离心5min后弃上清,加入100μLPBS吹散细胞,取50μL滴于载玻片上,荧光显微镜观察。13　　1.2.3RGS1基因对转录