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冰片对麻醉大鼠海马GABA、GLU和β-EP表达的影响作者：王道刚，张钰琴，张光荣，凌江红【摘要】目的探讨冰片对麻醉大鼠海马齿状回区γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(GLU)、β-内啡肽(β-EP)表达的影响。方法SD雌性大鼠55只，随机分为空白组5只，模型组、乙醇对照组、冰片(低、中、高3个剂量)组各10只。低、中、高剂量3个剂量冰片组预先给予冰片乙醇溶液灌胃，乙醇对照组给予等量的乙醇溶液。用药3d后，水合氯醛麻醉大鼠，应用免疫组织化学的方法，研究冰片预处理对麻醉大鼠海马内GABA，GLU和β-EP的表达的影响。结果GABA、GLU及β-EP在各组大鼠大脑海马齿状回区均有表达。模型组、乙醇对照组与空白组大鼠海马齿状回GABA表达量无明显差别，低、中、高剂量冰片组GABA表达量均较空白组及模型组显著减低(P<0.01或P<0.05)。各组大鼠海马齿状回区GLU表达均无显著差别(P>0.05)。模型组大鼠海马齿状回β-EP表达量较空白组明显减低(P<0.05)，中、高剂量冰片组β-EP的表达量较模型组明显增加(P<0.01或P<0.05)，高剂量组较乙醇对照组亦有明显的增加(P<0.05)。结论降低麻醉大鼠海马GABA的表达和增加β-EP的表达可能是冰片“开窍”作用机制之一。【关键词】冰片;昏迷;催醒;神经递质11 芳香开窍药冰片功能开窍醒神，用于闭证神昏。近年冰片作用机制研究主要集中在其通过血脑屏障和脑保护方面[1～3]，其影响神经递质的研究尚较缺乏。本实验拟通过观察冰片溶液对麻醉大鼠海马内γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(GLU)、β-内啡肽(β-EP)的影响，进一步探讨冰片开窍醒神的作用机理。 1材料与方法 1.1动物SD大鼠，清洁级，雌性，体质量(200±20)g/只，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2003-0003。 1.2用品机制冰片(购于湖南株州松本林化有限公司)，冰片溶液先由冰片与95%乙醇配制而成，分别为5，20，40g/100ml三种质量体积分数的溶液，4℃密封保存，使用时取0.1ml/200g大鼠体质量，稀释至3ml混悬液，等同于乙醇浓度为3.2%;GABA多克隆抗体、GLU多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色剂(武汉博士德);多聚甲醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司，级别均为分析纯)。 1.3动物分组、造模与取材取大鼠55只，随机分成空白组5只，模型组、乙醇对照组、冰片组(低、中、高3个剂量组)各10只。低、中、高剂量冰片组分别给予冰片乙醇溶液3ml灌胃311 d，乙醇对照组给予同浓度(3.2%)同剂量(3ml)的乙醇溶液灌胃，模型组及空白组不予灌胃药物。第3天给药后，除空白组外，所有大鼠应用水合氯醛(350mg/kg)麻醉，待翻正反射恢复(大鼠连续3次仰卧后恢复站立为翻正反射恢复)后再次应用1/2原剂量的水合氯醛麻醉，10min后，剪开胸腹腔，暴露心脏，将20号注射针头(切成平头磨钝)从左心室插入主动脉，用止血钳固定，剪开右心耳，快速灌注生理盐水300～500ml冲洗，至大鼠肝脏发白，流出液基本无色为止。随后灌注4%多聚甲醛先快速灌注100ml再缓慢灌注400ml，至头颈与四肢均已发硬。静置30min后断头取脑，置于4%多聚甲醛中，放入4℃冰箱固定3～4h，依次经过脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤制作成蜡块。空白组大鼠应用水合氯醛(175mg/kg)麻醉后，用以上方法取材、固定、包埋后备用。 1.4GABA、GLU及β-EP检测方法应用免疫组织化学方法，依据博士德试剂使用说明书操作。其中一抗操作浓度为1∶100，以PBS液代替一抗作为阴性对照。 1.5图像分析及数据处理采用Lecia显微镜高清彩色病理图像分析系统对切片进行图像分析。所有切片分析在同一强度，同一放大倍数(40×10)下进行。利用Image-ProPlus6.0图像分析软件，检测阳性信号的积分光密度(IntegratedOpticalDensity，IOD)，将每张切片选取3个视野，取平均值来计算免疫组化阳性信号的IOD的平均值。所得数据以±s表示,11 应用SPSS13.0统计软件统计，多组间比较用单因素方差分析(One-WayANOVA)，方差齐采用LSD方法，方差不齐采用Games-Howell方法。P<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1各组大鼠海马齿状回区GABA、GLU和β-EP表达的细胞定位 大鼠脑组织内GABA、GLU、β-EP免疫阳性物质在脑内分布广泛。GABA于海马齿状回颗粒细胞的胞膜胞浆均着色，如图1～3所示，高剂量冰片组较模型组和空白组阳性表达减少;GLU于胞浆内着色，如图4～5所示，低剂量冰片组与空白组阳性表达无明显差别;β-EP于胞浆胞核均有着色，着色较浅，呈黄色或棕黄色，如图图6～8所示，高剂量冰片组较模型组阳性表达增多。 2.2各组大鼠海马齿状回区GABA、GLU和β-EP表达的比较模型组、乙醇对照组与空白组大鼠海马齿状回GABA表达量无明显差别，低、中、高剂量冰片组GABA表达量均较空白组及模型组显著减少(P<0.01或P<0.05)。各组大鼠海马齿状回区GLU表达均无显著差别(P>0.05)。模型组大鼠海马齿状回β-EP表达量较空白组明显减少(P<0.05)，中、高剂量冰片组β-EP的表达量较模型组明显增加(P<0.05或P<0.01)，高剂量组较乙醇对照组亦有明显的增加(P<0.05)。结果见表1。11 3讨论 意识是脑干、间脑和大脑皮质之间结构上相互密切联系和功能上相互影响的结果。通常认为，脑干上行网状激活系统是维持大脑皮层的兴奋性，使机体处于觉醒状态，从而保持意识存在的主要结构，其功能障碍或结构受损是意识障碍的主要机制。脑内的抑制性神经递质、兴奋性神经递质，以及多种内啡肽都在昏迷与觉醒过程中发挥了重要的作用[4]。大鼠大脑海马区是全麻药物的作用部位之一，GABA、GLU以及β-EP等多种神经活性物质在此都有较为丰富的分布，这些物质是海马多种生理功能的物质基础，在全麻药作用下，大脑功能发生改变的同时必然伴有神经递质功能的改变。已有研究表明，麻醉药物可以通过多种神经递质及受体发挥其中枢抑制作用[5，6]，本实验应用水合氯醛麻醉大鼠，建立意识障碍的非损伤模型，更利于研究冰片对脑内神经递质的影响。海马齿状回皮层构筑的一个最突出的特点，就是神经元细胞有规则的排列，紧密排列的细胞使海马界限非常明确，成显著的带状，更易于实验观察。表1GABA、GLU、β-EP在海马齿状回区的表达图1空白组大鼠海图2模型组大鼠海马齿状回内GABA免疫马齿状回内GABA免疫反应阳性表达(40×10)反应阳性表达(40×10)图3高剂量冰片组大鼠海图4空白组大鼠海马齿状回内GABA免疫马齿状回内GLU免疫反反应阳性表达(40×10)应阳性表达(40×10)图5低剂量冰片组大鼠海图6空白组大鼠海马齿状回内GLU免疫11 马齿状回内β-EP免疫反应阳性表达(40×10)反应阳性表达(40×10) GABA是由GLU经过谷氨酸脱羧酶作用脱羧而生成，是一种重要的抑制性神经递质，具有神经保护、兴奋抑制和抗癫痫的作用，在脑内分布广泛，在神经元细胞浆内浓度很高[7]。GABA可抑制N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体耦联的离子通道和电压依赖性钙通道的开启，最终使神经元处于“稳态”而平衡缺氧损伤造成的神经元异常兴奋。GABA与GABA受体结合后，细胞膜的氯电导增强，开启氯离子通道，就引起氯离子向细胞内转移，产生超极化电位，降低神经细胞的兴奋性，抑制神经元放电，对抗去极化刺激的兴奋反应，产生突触后抑制效应[8]。张惠等[6]检测到麻醉时人脑海马等多个脑区内GABA水平明显升高，在本实验中，冰片降低了麻醉大鼠海马内GABA的表达，提示冰片可能通过降低脑内GABA发挥其开窍作用。图7模型组大鼠海图8高剂量冰片组大鼠海马齿状回内β-EP免疫马齿状回内β-EP免疫反应阳性表达(40×10)反应阳性表达(40×11 10) GLU作为最重要的兴奋性神经递质，脑内的含量比GABA更丰富[4]，海马神经元以谷氨酸作为主要的神经递质，谷氨酸能激活海马CA1区和齿状回的NMDA受体，与之相结合，致使钙通道开放，突触膜内钙浓度升高，继而促发一系列生化反应而发挥作用[9]。理论上，会随着促醒药物的作用而有所增加，表现出与GABA相反的变化趋势。适量的GABA与GABA受体结合可抑制下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴激活，进而抑制兴奋性氨基酸含量增高，而GABA含量下降时，对HPA轴活动的抑制作用减弱，HPA轴活动增强，致使GLU等兴奋性氨基酸持续增高[10]。但本实验中，冰片对GLU的表达量的影响并不大，有增加的趋势，差异没有统计学意义。吴东辉等[11]研究表明，急性应激(即应激第1天)对大鼠海马兴奋性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的含量无明显影响，而GABA含量明显下降;并且应激第3天后谷氨酸和天冬氨酸的含量均显著升高，随着应激天数的增加而维持于较高水平。这也提示我们，GLU的变化可能较迟缓，致使我们实验结束时并未检测到GLU的升高。 β-EP为内源性阿片肽之一，来源于丘脑弓状核前阿黑皮素原系统，经下丘脑垂体门脉系统进入血液中，应激是促进β-EP分泌及释放的重要因素。它同时是一种强烈的阿片受体激动剂，与受体结合后，可明显抑制中枢和外周神经递质的释放和神经元的电生理活性，产生一系列病理生理变化。目前已有大量研究表明在脑梗塞或脑出血等发生时，血浆β-EP明显升高，加重造成脑内其他神经递质代谢障碍，使细胞膜Na+-K+-ATP酶失活，导致神经元的代谢及电生理活动的抑制作用加强，从而加重意识障碍和中枢神经系统紊乱[12～14]。本研究发现，模型组大鼠海马齿状回β-EP的表达量较空白组明显减少，乙醇对照组和低剂量冰片组β-EP的表达量较模型组无明显差别，而中、高剂量冰片组β-EP的表达量较模型组明显增加，且高剂量冰片组与乙醇对照组相比亦有明显的增加，提示β-EP表达量的增加并非乙醇的作用，而应是冰片本身的作用。笔者认为，本研究数据表明中、高剂量冰片组β11 -EP表达量的增加，并不代表会加重意识障碍和中枢神经系统紊乱，可能的原因如下：本实验中动物模型是非损伤性模型，与脑梗塞及脑出血有明显的不同，并未引起大脑细胞明显的病理生理改变;β-EP属于内源性阿片肽，是机体抗痛系统的组成部分，在脑内和脊髓内均有镇痛作用，且脑内含量远大于脊髓，当机体有伤痛刺激时，内源性阿片肽被释放出来以对抗疼痛[4]，动物麻醉后，对外界刺激的反应受到明显抑制，在处死过程中或受到其他刺激时，β-EP并未出现升高，甚至随着麻醉的加深出现了降低，冰片的促醒，尤其中、高剂量作用同时增加了大鼠对疼痛等多种刺激的应激反应，β-EP也随之增加。另外，先前研究集中在检测血浆β-EP含量，在脑内β-EP释放入血，产生一系列病理变化，本实验中检测到的β-EP变化趋势，是否是因为冰片抑制了它的释放，致使其在脑内的表达增加，还有待进一步研究。 综上所述，本研究表明，降低海马内GABA的表达和增加β-EP的表达可能是冰片“开窍”作用机制之一。【参考文献】 [1]陈艳明,王宁生.冰片对血脑屏障体外模型细胞间紧密连接和细胞吞饮囊泡的影响[J].中国中西医结合杂志,2004,24(7):632. 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