两种方式制备的原核表达含tat蛋白转导域融合蛋白穿膜能力比较

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1、两种方式制备的原核表达含TAT蛋白转导域融合蛋白穿膜能力比较作者：许逊，蔺昕，田雨香，招倩倩，季宝菊，刘静，夏圣，王胜军，许化溪，邵启祥【摘要】　　目的：联合应用多种技术评价不同方式制备的TAT转导结构域eGFP目的蛋白的穿膜效率及亚细胞定位情况，以期建立有效、稳定的高效穿膜蛋白制备方法。方法：诱导表达、纯化包涵体形式融合蛋白，分别进行直接脱盐和透析复性，并与细胞共育，然后通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜及免疫印迹法评价融合蛋白穿膜能力。结果：通过透析复性制备的融合蛋白穿膜效率极低；而纯化后直

2、接脱盐的融合蛋白经流式细胞术、激光共聚焦显微镜及免疫印迹等方法分析，表明均具有高效穿膜能力。结论：两种方式制备的融合蛋白均能穿膜，但透析复性制备的蛋白穿膜效率低，且不易定位于细胞核中，影响进一步对该目的蛋白在胞核中生物学行为的研究；而脱盐的变性蛋白具有高效的穿膜效率。【关键词】转导结构域；透析；复性；包涵体；穿膜效率　　［Abstract］Objective:ToevaluatetheefficacyandsubcellularlocalizationofthefusionproteineGFP

3、interestproteinincludingproteintransductiondomainofTATby16multitechnologyandtoobtainthemoreeffectivecellularuptakeproteinforthefurtherresearchofitsbiologicalfunction.Methods：InducedtheExpressionoffusionprotein,andextractedandpurifieditfromtheinclusio

4、nbodies.Jurkatcellsexposuretofusionproteinwhichwasdirectlydesaltedandrefoldedviadialysis,respectively.Flowcytometryanalysis,confocalmicroscopeobservationandWesternblotdetectionwereusedtoevaluatetheefficacyofthefusionproteintotransduceintothecellcytopl

5、asm.Results：Theresultsofthedetectedbyflowcytometry,confocalmicroscopeandWesternblotindicatedthatthefusionproteinwhichdesaltedbyPD10columncouldpenetrateJurkatcellsmoreefficiently,contrasty,therenaturatedproteinviadialysishadlowactivity.Conclusion：Both

6、ofthefusionproteinstreatedwithtwodifferentmethodscouldtranslocatethroughthecellmembranes，butthedialyzedfusionproteinhadlowefficiencyanddidn′tlocateintocellnucleus,woulddisbennifitforthefollowingresearchworkaboutthebiologicactivityandbehaviorofthefusio

7、nproteinontranscriptionallevel.　　［Keywords］proteintransductiondomain;dialysis;refolding;inclusionbodies;efficacyoftransducethroughthe16cellsmembrance通过细胞穿透肽进行蛋白转导是体外蛋白传递的一种有效方法。最常用的蛋白转导肽就是HIVTAT基因的第一个外显子编码的第48～56位氨基酸残基，其具有核定位和蛋白转导结构域（proteintransduct

8、iondomain，PTD）［1,2］。Green等［3］和Frankel等［4］早先发现胞外的HIVTAT能够穿过胞膜进入细胞到达胞核。此后对TAT蛋白的体内外进一步研究发现了其中第48～56位中的9～11个氨基酸残基是蛋白转导的关键区域，该区域能转导自身及与其融合蛋白进入细胞。在体外只要将TAT融合蛋白直接添加到细胞培养介质中即可起效［5-8］。PTD的穿透原理未完全明确，目前认为PTD可能由乙酰肝素硫酸脂蛋白聚糖（HSPG）介导的内摄作用进入细胞［9,10］。大肠埃希菌表达