ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nnos及nnos mrna表达的影响

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1、Ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nNOS及nNOSmRNA表达的影响作者：冯荣芳刘凌云石卫东李娜冯亚青【摘要】目的阐明Ⅱ组代谢型谷氨酸受体（metabotropicglutamatereceptor2/3，mGluR2/3）对老年性痴呆（AD）发病过程中一氧化氮（NO）的影响。方法应用免疫组化和原位杂交方法，观察脑室应用Ⅱ组mGluR2/3阻断剂α甲基(4四唑基苯)甘氨酸(MTPG)对脑室β淀粉样肽（Aβ）注射所致的AD大鼠神经型一氧化氮合酶（nNOS）及其mRNA表达的影响。48只SD大鼠随机分为假手术组、痴呆组、痴呆组+MTPG组，每组16只。各组大

2、鼠均在Morris水迷宫测试后常温饲养1w后取材观察。结果假手术组海马CA1区锥体细胞轮廓清楚，排列整齐，胞浆有较弱的nNOS表达。痴呆组nNOS表达较假手术组明显增加，同时锥体细胞数目变少，锥体神经元的轮廓、形态出现明显的损伤性改变；脑室注射mGluR2/3阻断剂MTPG，可部分阻断AD引起的nNOS表达增加，对神经元的形态也有恢复作用。原位杂交与免疫组化显示相似的变化趋势。结论mGluR2/3参与AD发病过程，NO信号通路可能发挥重要作用。【关键词】脑室Aβ注射；神经型一氧化氮合酶；代谢型谷氨酸受体；α甲基(4四唑基苯)甘氨酸;SD大鼠12代谢型谷氨酸受体(metab

3、otropicglutamatereceptors，mGluRs)是脑内广泛存在的、与G蛋白偶联的膜受体，参与脑内许多生理、病理过程。研究证实，mGluRs参与脑缺血耐受的发病机制〔1〕，并在老年性痴呆(AD)的发病中起一定作用。一氧化氮(NO)作为非经典神经介质参与许多与谷氨酸受体激活相关的生理、病理过程〔2〕，如海马的长时程突触传递增强和小脑的长时程突触传递抑制、神经递质释放的调节、动物的学习和记忆〔3〕以及缺血耐受过程等〔4〕。本实验采用免疫组织化学和原位杂交方法，观察脑室应用Ⅱ组mGluR阻断剂α甲基(4四唑基苯)甘氨酸(MTPG)对AD发病过程中NO的影响。　　

4、1材料与方法　　1.1实验动物及分组健康雄性SD大鼠48只，体重250～280g（由河北医科大学实验动物中心提供)，随机分为假手术组、痴呆组和痴呆+MTPG组，每组16只。①假手术组：进行所有手术操作,注射等量蒸馏水。②痴呆组：于大鼠左侧脑室缓慢注入凝聚态β淀粉样肽（Aβ2535）（浓度为4g/L）5μl；③痴呆+MTPG组：大鼠左侧脑室注入Aβ25～35后1w，于右侧脑室注射MTPG0.04mg(MTPG溶于人工脑脊液)，其他两组均右侧脑室注入等量人工脑脊液。4w后进行Morris水迷宫检测，各组大鼠均于Morris水迷宫测试后1w处死，其中8只用于脑组织病理学检测和免疫组

5、化染色，8只用于原位杂交。12　　1.2痴呆大鼠模型的复制Aβ老化的处理：将Aβ25～35(片段序列为：HGSNKGAIIGLMOH)溶于蒸馏水(蒸馏水有利于Aβ25～35聚合)，浓度为4g/L，在37℃保温箱中孵育4d，使其变为凝聚态Aβ。参照文献〔5〕的方法复制痴呆大鼠模型：大鼠在10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉下，固定于江湾1型C大鼠立体定位仪上，常规消毒，切皮，暴露前囟，依据大鼠脑立体定位图谱，于前囟后0.8mm，中线左旁开1.5mm，用牙科钻开颅，切开硬膜，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0mm(AP：-0.8mm，ML：1.5mm，DL：4.0mm)，于

6、左侧脑室缓慢注入凝聚态Aβ25～355μl，留针5min，缓慢撤针；对照组动物经历同样的手术程序，注射等量蒸馏水。关闭切口，待动物清醒后，送回养笼，自由饮水，饮食。MTPG右侧脑室注射：方法同上，在AD建模后1w，于前囟后0.8mm，中线右旁开1.5mm)，用牙科钻开颅，切开硬膜，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0mm(AP:-0.8mm，ML:1.5mm，DL:4.0mm)，注射MTPG(4mg/ml，溶于人工脑脊液)，每次注射MTPG10μl，1min内注完，留针5min；其他两组动物经历同样的手术过程，分别注射等体积的人工脑脊液；注射4w后进行Morris水迷宫测试。　　1

7、.3Morris水迷宫测试大鼠空间学习记忆能力测试采用中国医学科学院研制的大鼠Morris水迷宫装置。测试包括定向航行试验和空间探索试验。在水迷宫水槽壁上标明124个入水点，将水槽等分为4个象限，逃避平台置于第三象限。水槽内充以洁净自来水，水面高出平台2cm,并加入适量奶粉使水浑浊,水温控制于（20±2）℃。实验前1d将大鼠放入不含平台的水槽中2min,使其适应迷宫环境及游泳。试验共7d。前6d进行定向航行试验将大鼠从入水点置入水槽中，记录60s内大鼠从入水到爬上平台所需时间即潜