hplc法测定丹参超临界萃取物中丹参酮ⅱa的含量

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1、HPLC法测定丹参超临界萃取物中丹参酮ⅡA的含量【关键词】,高效液相色谱法[摘要]目的:建立超临界流体萃取(supercriticalfluidextraction,简称SFE)技术和高效液相色谱(HPLC)技术联用测定丹参中主要成分丹参酮ⅡA含量的方法。方法:探讨改性剂、温度、压力等条件对回收率的影响,确定SFECO2萃取丹参中丹参酮ⅡA的最佳条件;并采用HPLC法对萃取成分中丹参酮ⅡA进行定量分析,确定最佳的色谱分析条件。结果:用超临界流体萃取丹参的最佳萃取条件为:萃取压力30MPa,萃取温度45℃;分离釜I压力16MPa,温度40℃;分离釜Ⅱ压力8MPa,温度33℃;CO2流量

2、为3.3L/h:萃取时间6h;改性剂用丙酮,流速为0.3L/h。最佳色谱条件:ODSC18色谱柱(4.6mm×250mm),流动相为甲醇水(V∶V=75∶25),紫外检测波长270nm,流速1.0ml/min。丹参酮ⅡA浓度在23.36μg/ml~116.80μg/ml范围内,峰面积与进样量线性关系良好,平均回收率为99.12%,RSD=1.99%。结论:用SFEHPLC联用提取测定丹参中主要成分丹参酮ⅡA回收率高、方法快速简便、结果准确、灵敏度高、重现性好。  [关键词]高效液相色谱法;超临界流体萃取;丹参;丹参酮ⅡA9  丹参是我国传统使用的中药,具有祛瘀止痛、活血通经、清新除烦

3、之功效,能抑制血小板黏附、聚集和释放,扩张血管和改善微循环,近年来还证实具有抗氧化和钙拮抗作用[1]。药理研究表明,丹参主要有效成分包括丹参素、丹参酮、原儿茶醛。其主要化学成分之一丹参酮ⅡA有明显的抗炎作用,并广泛应用于冠心病的治疗[2],近年来还被应用于肿瘤的治疗[3]。《中华人民共和国药典》(2000年版)以丹参酮ⅡA作为标定丹参的主要成分[4]。超临界CO2流体萃取(简称SFECO2萃取)技术是近20年来发展起来的在分离领域出现的一种新技术[5]。它与常规溶剂萃取的区别是选用一种称为超临界流体(SF)的物质代替有机溶剂作为萃取剂。它是利用在临界点附近,体系温度和压力的微小变化可

4、导致物质溶解度发生几个数量级的突变的特性实现物质的分离。该法具有无毒、快速、廉价、低温操作等优点。本实验采用HPLC法对丹参超临界萃取物中丹参酮ⅡA的含量进行定量测定。  1材料与方法  1.1实验仪器SFE-1型超临界萃取器(大连八达空间科学应用技术研究所),本系统由萃取釜、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ、制冷机、高压泵和净化器6部分组成。日本岛津LC-10AD型高效液相色谱仪,77251进样阀(Rheodyne9USA,附20μl定量环管),SPD-10A紫外可变波长检测器(JAPAN),ODS-C18色谱柱(4.6mm×250mm);江申色谱工作站;V-560紫外分光光度计(JASCO日本

5、分光株式会社);TG328A型分析天平(上海天平仪器厂),SK-1快速混匀器;CQ250超声波清洗器(上海超声波仪器厂),真空泵(天津)、针筒式油膜过滤器(0.45μm)(大连伊利特科学仪器有限公司)。  1.2药材与试剂丹参(安徽毫州,批号021112);丹参酮ⅡA标准品(中国药品生物制品鉴定所);CO2(大连化学物理研究所);甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂开发中心);丙酮为分析纯;水为去离子水。  1.3超临界流体萃取过程将丹参的根茎切粒后投入萃取釜中,按设定的萃取路线:CO2钢瓶―冷冻系统―高压泵―萃取釜―分离釜I―分离釜Ⅱ―净化器―CO2贮罐(循环用)。分别对萃取釜、分离

6、釜I、分离釜Ⅱ进行加热,当温度分别达到45℃、40℃、33℃时,通过高压泵对萃取釜、两个分离釜进行加压,当压力分别达到30MPa、16MPa、8MPa时,开始循环萃取,并保持恒温恒压,CO2流速3.3L/h。萃取分离时每隔一定时间放出萃取产物。图1:SFECO2流程示意图(略)  1.4色谱条件ODSC18柱(4.6mm×250mm),流动相为甲醇∶9水(V∶V=75∶25),紫外检测波长270nm,流速1.0ml/min,温度为室温,进样量为20μl。  1.5标准溶液的配制丹参酮ⅡA标准品至干燥器中干燥24h,精密称取14.64mg,置25ml棕色容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,再

7、配制成每毫升含23.36μg,46.72μg,70.08μg,93.44μg,116.80μg,140.16μg的标准品甲醇溶液,放入冰箱冷藏室保存。  1.6标准曲线的制备在上述色谱条件下进样测定,记录丹参酮ⅡA的色谱图,见图1(略)。每个实验点重复进样3次,分别记录峰面积,计算峰面积平均值(Y),结果见表1。以丹参酮ⅡA标准品的峰面积均值(Y)对其浓度(X)作图,绘制标准曲线,见图2。对其进行线性回归得回归方程为:Y=5.27×105X-1.31×10

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