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1、Clusterin抗原的表达、抗体制备及其初步鉴定作者:张迎春,刘莹,杨金菊,柳晓兰,迟俊,高建恩,唐晓波,朱大岭,孙启鸿【摘要】 目的:制备Clusterin(CLU)多克隆和单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX4T1CLU和PET32aCLU。GSTCLU融合蛋白在大肠杆菌中表达,被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb。采用ELISA法和Westernblot鉴定抗CLU抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性。采用Westernblot,间接免疫荧光,免疫组化鉴定mAb的特异性。结果:
2、GSTCLU融合蛋白在相对分子质量(Mr)约54000处呈现明显表达条带。Westernblot鉴定表明,制备的抗CLU兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中Mr约52000和58000的CLU蛋白。获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU蛋白,其中有2株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白,4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白。结论:成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb,为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础。【关键词】Clusterin原核表达多克隆抗体单克隆抗体15 [Abstract]AIM:To
3、preparerabbitpolyclonalantibodies(pAb)andmousemonoclonalantibodies(mAbs)againsthumanclusterin(CLU)andcharacterizetheseantibodies’properties.METHODS:CLUfragmentwasamplifiedfromhumanlivercDNAlibrary,andrecombinantexpressionvectorspGEX4T1CLUandPET32aCLUwereconstructed.GSTCLUfusi
4、onproteinwasexpressedinE.coliandthenusedastheimmunogen.PropertiesofantiserumagainsthumanCLUwereidentifiedbyELISA,Westernblot,andthemAbsagainsthumanCLUwascharacterizedbyWesternblot,indirectimmunofluorescentstainingandimmunohistochemistrystaining.RESULTS:TheGSTCLUfusionproteinwashig
5、hlyexpressedwithamolecularweightof54000.WesternblotanalysisprovedthattherabbitpAbcouldspecificallyrecognize52000and58000proteinsinhumanlivertotalprotein.AllofthenineestablishedmAbsrecognizedrecombinanthumanCLUprotein,twoofwhichspecificallyboundtoproteinsinthecytoplasmofHepG2cellsan
6、dfourofwhichspecificallyboundtoproteinsinthecytoplasmofadultlivertissue.CONCLUSION:pAbandmAbsagainsthumanCLUweresuccessfullyprepared,whichwillprovideefficienttoolsforfunctionalstudiesofCLUexpressedinhumantumors.15 [Keywords]clusterin;prokaryoticexpression;polyclonalantibody;monocl
7、onalantibody Clusterin(CLU)是一种普遍存在的异源二聚体硫酸化糖蛋白,其基因定位于人类染色体8p21,含449个氨基酸,相对分子质量(Mr)为75000~80000。它主要存在于细胞质中并被分泌到细胞内环境,由于CLUmRNA不同的剪切翻译,形成sClusterin(sCLU)和nClusterin(nCLU)2种变体,分别发挥抗凋亡和促进凋亡的作用[1,2],因其功能多样化,又名为TRPM2,SGP2,XIP8,ApoJ(apolipoproteinJ),SP4040。在生理条件下,主要参与脂质转运、组织重建、细胞与基质
8、间相互作用及细胞凋亡等生物学过程[3]。在病理条件下