h9n2亚型禽流感病毒m基因的克隆与序列分析

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1、H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆与序列分析动物医学进展,2006,27(2):58—62ProgressinVeterinaryMedicineH9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆与序列分析罗琴芳,张欢,郭霄峰¨(1.华南农业大学兽医学院.广东广州510642;2.新疆塔里木大学,新疆阿拉尔843300)中圈分类号:$852.559.5文献标识码:A文章编号:1007—5038(2006)02—0058—05摘要:对分离自中国南方的H9N2亚型禽异性,其抗原性的差异是流感病毒的分型依据之一.流感病毒A/Chicken/Guangx

2、i/KMⅢ/99Mz蛋白由97个氨基酸组成,在病毒穿人过程中起(H9N2)的M基因进行克隆和序列分析.序列分析表明,该M基因全长1027bp,包含2个读码框,可分别翻译出M和Mz2种蛋白质.M由252个氨基酸残基组成,M2由97个氨基酸残基组成.与不同毒株比较,结果显示,该M基因与A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)同源性为1009/6,当A/Chicken/Guangxi/9/99(H9N2)同源性为99,与A/Chicken/Guangdong/5/97(H9N2),A/Chicken/Guangd0ng

3、/11/97(H9N2)等中国分离株同源性达98.关键词:M基因克隆;序列分析H9N2亚型禽流感病毒禽流感(Avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)引起的禽的一种急性,烈性传染病.于1878年首次在意大利暴发流行.现已蔓延至美国,英国,澳大利亚,爱尔兰,比利时,荷兰,法国,俄罗斯,加拿大,以色列,匈牙利,日本,中国,中国香港等[1]国家和地区.1997年的香港禽流感事件,2004年东南亚禽流感的广泛流行并致人死亡,已充分表明该病毒已突破种问屏障,给人类的健康带来严重的威

4、胁.禽流感病毒的主要免疫原性相关蛋白包括血凝素(HA),神经氨酸酶(NA),核蛋白(NP)和基质蛋白(M).其中Ml(Matrixprotein)蛋自由病毒基因片段7编码,位于囊膜蛋白的内侧,是病毒粒子的主要蛋白.M基因至少有2个阅读框,分别翻译2种蛋白M.和M.M.由252个氨基酸残基组成,是病毒的主要结构蛋白,是核衣壳的主要成分,具有型特离子通道作用[23,M.蛋白的N端膜外区十分保守,是免疫识别的重要表位.因此,研究AIVM基因序列与功能,对于阐明AIV的进化及其疫苗研究具有重要意义.本研究对目前广泛流行的H9N2亚型禽流感

5、病毒,M基因进行克隆,测序及序列分析,从分子水平分析M基因的变异程度.1材料与方法1.1材料1.1.1病毒禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KM[]I/99(HgN2)株(缩写为KMⅢ99)由华南农业大学兽医学院微生物教研室保存.1.1.2引物P1:5AGCAAAAGCAGG3.P2:5AGTAGAAACAAGG3,由上海生工生物工程公司合成.1.1.3质粒及工程菌pMD18一T载体质粒系统购自宝生物工程(大连)有限公司.基因工程菌DH5a由华南农业大学兽医学院微生物教研室保存.1.1.4工具酶及其他相关试剂Taqpl

6、us,dNTP,琼脂糖(电泳纯)购自上海生物工程公司.TrizolGIBCO公司产品,AMV反转录酶,RNsin为Pro—mega公司产品.200bpLadder,MarkerⅢ购白天为时代生物工程公司.PstI购自宝生物工程(大连)有限公司.胶回收试剂盒购自0MEGA公司.1.2方法1.2.1病毒RNA的抽提按华美生物工程公司总RNA抽提试剂盒的方法进行.1.2.2M基因的RT-PCR扩增取1OL提取的vRNA,进行反转录,反转录按Promaga公司AMV试剂说明书进行.反应完毕,95℃灭活5min,收稿日期:2005-09-1

7、9基金项目:国家自然科学基-~-(30270987,30440010)?广东省自然科学基-'~'(020996)作者简介:罗琴芳(197O一),女,新疆阿拉尔人.讲师.博士研究生.主要从事动物病毒学研兜.*通讯作者罗琴芳等:HgN2亚型禽流感病毒M基因的克隆与序列分析4℃保存.再以cDNA作为PCR模板,取cDNA1L按上海生物工程公司TaqplusDNA聚合酶说明书进行扩增.PCR程序:94℃3Os,46℃4OS,72℃60s,30次循环,最后72℃延伸8min.反应产物用8g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.1.2.3PCR产物克隆,鉴

8、定参照文献[3]进行.从15g/L低熔点琼脂糖凝胶切胶回收约1000bp的扩增片段,直接与pMD18一Teasy载体连接,转化感受态DHSa,挑取AMP平板白色菌落提取质粒,PCR鉴定阳性克隆.同时,在另一反应体系中加人I,酶切鉴定可疑质粒.使用A