妊娠子宫肌中促肾上腺皮质激素释放激素受体的研究

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1、妊娠子宫肌中促肾上腺皮质激素释放激素受体的研究【关键词】妊娠人类妊娠是一个复杂而又需机体各部分协调运转的过程。子宫肌层由静息到收缩的机制很复杂，目前还在探索中。妊娠期众多激素的变化引起人们广泛的关注，其中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）近年来成为人们关注的焦点。CRH是脑肠肽家族中的一种，于1955年最早发现于下丘脑室旁核，之后在许多外周组织中，如免疫和炎症细胞、心脏、骨骼肌、甲状腺、皮肤、生育组织中发现了它的存在［1～3］。胎盘是妊娠期母体CRH的主要来源。人们发现母体血浆CRH水平随着妊娠继续而逐渐升高，分娩前达到高峰，产后迅速下降；早产患者的CRH

2、峰较正常妇女提前，提示母体血浆CRH水平与分娩密切相关［4］。CRH可能通过与雌激素、肾上腺皮质激素、前列腺素和缩宫素等的相互作用，建立分娩启动的正反馈环［2，5］。在妊娠子宫宫底部CRH发挥收缩作用，而在下段舒张子宫平滑肌，这可能与受体和（或）传导通路不同有关［6，7］。本研究通过对子宫下段平滑肌层中CRH受体和（或）亚型的研究，进一步揭示CRH在分娩过程中的作用机制。1对象与方法1.1研究对象（1）宫缩组：随机抽取足月因产科因素行剖宫产、已有宫缩者，排除合并恶性肿瘤者，共15例，平均27.55（24～36）岁。（2）无宫缩组：随机抽取足月因产科因素行剖

3、宫产、无宫缩者，排除合并恶性肿瘤者，共14例，平均30.64（25～41）岁。（3）未妊娠组：随机抽取因子宫肌瘤行子宫切除患者，排除合并恶性肿瘤者，共15例，平均46.59（40～54）岁。1.2主要试剂与仪器无水乙醇（上海试剂一厂），三氯甲烷、异丙醇（中国医药上海化学试剂公司），焦炭酸二乙酯（DEPC）、Trizol（上海华舜生物公司），dNTP、Oligo(dT)（上海生工生物工程有限公司），M-MLV反转录酶、TapDNA聚合酶（Promega公司），核糖核酸酶抑制剂（TaKaRa公司），Milli-Q纯水制备装置（Millipore公司），PCR仪

4、（Eppendorf公司），DNA电泳槽（WEALTEC公司）。1.3主要溶液的配制（1）DEPC-H2O:双蒸水1000ml加DEPC1ml，37℃摇动过夜，然后高压灭菌。（2）75%酒精：125mlDEPCH2O加375ml无水乙醇，混匀至终体积500ml。（3）50×TAE电泳缓冲液：Tris242g、100ml0.5mol/LEDTA（pH=0.8），加冰醋酸57.1ml，用蒸馏水定容至1000ml，临用前按需用蒸馏水稀释成1倍的工作液。1.4研究方法1.4.1子宫标本的收集（1）于子宫下段切口正中上缘切取适量新鲜子宫肌层标本放入经过DEPC水处理

5、的10ml离心管（冰中）内；（2）每个离心管内加入2mlTrizol；（3）于1h内用电动匀浆机匀浆（冰浴中操作），26000rpm持续15s以彻底裂解组织；匀浆液于-80℃保存，待提取RNA。1.4.2总RNA的提取及浓度测定（1）总RNA的提取：按照上海华舜生物公司TrizolReagent操作说明书进行。①室温溶解组织匀浆液：将组织匀浆液1ml移至1.5ml离心管，室温静置8min；②各管加入0.2ml三氯甲烷；③用力颠倒混匀，室温静置8min；④4℃，12000×g离心15min；⑤将上清液小心移至另一个1.5ml离心管；⑥各管加入等体积异丙醇，振

6、荡，室温静置10min；⑦4℃，7500×g离心15min；⑧小心弃上清液，各管加入75%乙醇1ml；⑨充分洗涤，4℃下7500×g离心10min；⑩弃上清液，空气中干燥15～20min；各管加入20μlDEPCH2O溶解RNA。（2）总RNA纯度和浓度测定：采用紫外分光光度法，测定RNA样品在波长260nm和280nm的紫外吸收值。根据OD260为1时相当于RNA40μg/ml确定RNA的量，根据OD260/OD280的比值来判断RNA样品的纯度，比值位于1.8～2.0之间视为RNA纯度优良。总RNA抽提后，行RNA甲醛变性凝胶电泳，观察18s、28sR

7、NA的完整性及二者比例，来判断RNA的完整性。1.4.3RTPCR方法（1）反转录（reversetranscription,RT）：按照Promega公司反转录酶MMLV操作说明书合成cDNA第一链：①取2μg总RNA和1μgOligo（dT）分别放入同一个1.5ml离心管中；②70℃水浴5min；③冰上急冷3min；④各管分别加入10mMdNTP1.25μl、MMLV1μl、RNA酶抑制剂0.75μl、反转录缓冲液5μl；⑤用DEPCH2O补齐至总体积为25μl，震荡、混匀后，离心；⑥42℃水浴60min；⑦70℃水浴15min；⑧-20℃保存备用。（

8、2）PCR反应：利用PCR引物序列CRHR1α（sense：5TC