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《stnfrⅱ和vip融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、sTNFRⅡ和VIP融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(5):69—73sTNFRlI和VIP融合蛋白的基因克隆表达,纯化及活性检测王虹曾位森陈金华王珊珊刘丹杨艳妮陈百宏李玲(广州蓝星生物科技开发有限公司广州510663)摘要可溶性肿瘤坏死因子受体11(sTNFRII)和血管活性肠肽(VIP)对类风湿性关节炎(RA)均有治疗作用,但两者的作用机制不同.制备两者融合蛋白,可能具有更好的防治类风湿关节炎的作用.用含有VIP基因序列的上游引物和sTNFRII的下游引物,用P
2、CR扩增出由连接序列将VIP和sTNFRII基因连接的片段,再亚克隆到原核表达载体pET32a,在大肠杆菌DH5c~内诱导表达.表达的产物经离子交换,疏水层析纯化,并用体外中和试验检测其抑制TNF细胞毒及肝细胞膜特异性脂蛋白(Lsp)诱导的细胞毒生物活性.结果显示构建的pET32a—VIP—sTNFRII表达载体在大肠杆菌DH5ct内以包涵体形式表达,疏水层析结合离子交换层析纯化后,融合蛋白具有较好的抑制炎症分子诱导的炎症反应生物活性,为将来应用打下基础.关键词sTNFRIIVIP融合蛋白表达纯化中图分类号Q786肿瘤坏死因子受体ii(T
3、NFRII)全长有439个氨基酸,其中胞外区有234个氨基酸.胞外区富含Cys重复序列,Cys呈棒状结构,主要负责与配基结合J.胞外区在特定的情况下可以脱离下来,形成可溶性受体(SolubeTNFreceptor,sTNFR).sTNFR不介导信号传递,但仍能与TNF结合,中和TNF的活性.当sTNFR过量,会与TNFR竞争结合TNF,众多实验证明sTNFR在体内,体外能中和TNF诱导的细胞毒性和免疫反应【.美国Immunes公司已研制出sTNFRII—IgGFc融合蛋白,用于治疗类风湿病.血管活性肠肽(vasoactiveintesti
4、nalpeptide,VIP)是由28个氨基酸组成的多肽,能在外周淋巴微环境中产生具有免疫学活性的神经肽.研究表明VIP有抗炎特性,在调节自身免疫方面发挥重要作用,成为治疗RA极有前景的新药物J.sTNFRII和VIP对治疗类风湿性关节炎(RA)的作收稿日期:2006-03-06修回日期:2006-04—10通讯作者,电子信箱:laxiwh@263.net用相似,但两者的作用机制并不相同.本文构建重组质粒,并在大肠杆菌中表达,经离子交换柱纯化,获得有生物活性的融合蛋白VIP-sTNFRII,以期在临床上有更好的治疗效果.l材料和方法1.1
5、材料质粒,菌株和细胞株:人心肌细胞cDNA文库购自LifeTechnology公司.pET32a,大肠埃希菌DH5ot,小鼠成纤维细胞L929为本实验室保存.试剂:氧化型谷胱甘肽(GSSG),还原型谷胱甘肽(GSH),精氨酸三羟甲基氨基甲烷(Tris),乙二胺四乙酸(EDTA)均为国产分析纯;LB培养基购于Sigma公司;胶回收试剂盒,广州天为时代公司;T4连接酶,异丙基硫代.B.D.半乳糖苷(IPTG),各种限制性内切酶和MMLV逆转录酶,肝细胞膜特异性脂蛋白(Lsp)均购自Promega公司;TNF—a2b标准品购自北京邦定公司;So
6、urce30Q离子交换介质,Phenyl-SepharoseFF疏水介质购于Pharmacia公司.引物合成和DNA测序委托上70中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1.26No.52006海invitrogen公司完成.1.2方法1.2.1VIP-sTNFRII融合蛋白基因克隆根据DataBank中的基因序列设计引物,上下游引物5端分别引入酶切位点BamHI和HindIII.上游引物为:5-TCTAGGAATAACTALTCCACTCTGATGCCGTCTFCACAGCACCCGCCTCAGAAAGCAAATGGCT
7、GTGAAGAAATACCTGAACTCCATCCTGAATGcAG6GGGCHGcAG6GGCG4CCGTCGGACTGGAGCTCT-3.下游引物:5'-CCCAAGCTTCAATCAGTCCAACTGGAAG.3.在上游引物中嵌入VIP的开放阅读框序列84bp(下划线部分),两个基因间用一个柔性短肽序列相连(斜体为连接肽序列).用PCR方法以人心肌细胞cDNA文库为模板扩增sTNFRII基因,并通过上游引物中引入VIP序列,获得VIP.sTNFRII融合基因.离心沉淀PCR产物,用BamHI和HindlI!双酶切,l%琼脂糖凝胶电泳
8、,切下目的条带(约800bp),DNA凝胶回收试剂盒纯化扩增产物.纯化的产物与经同样酶切的pET32a载体_5J混合,T4连接酶连接,构建pET32a-VIP-TNFRII表达质粒,转化至感受
